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芜菁胚发育相关基因BcNAC2的功能分析

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毕业论文范文题目:芜菁胚发育相关基因BcNAC2的功能分析,论文范文关键词:芜菁胚发育相关基因BcNAC2的功能分析
芜菁胚发育相关基因BcNAC2的功能分析毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】:花的发育是植物发育过程中最引人注目的事件,花芽的形成意味生殖生长的开始(卢海宇等,2009).Coen和Meyerowitz(1991)提出了花器官发育的ABC模型,这是植物发育分子生物学研究领域里程碑式的重大突破,也为人们打开了一扇通向花器官多样性研究的大门。在芸薹属作物中,雄性不育现象普遍存在,并且应用芸薹属作物的雄性不育性,利用杂种优势,提高产量,但雌性不育现象在芸薹属作物中却鲜有报道。本研究以芜菁(BrassicacampestrisL.ssp.rapifera(Matzg)Sinsk,syn.B.rapaL.)雌蕊退化突变体tpa(turnippistilabortion)及其野生型(可育株)雌蕊和胚发育转录组分析中发现的基因BcNAC2为研究对象,通过PCR扩增方法对芜菁BcNAC2的cDNA全长和DNA全长进行了分离、鉴定及蛋白质结构和功能的预测;从NCBI上搜索到相关的NAC蛋白进行同源比对,在此基础上构建分子进化树;采用半定量RT-PCR(Reversetranscriptasepolymerasechaieaction)技术分析该基因(略..)在芜菁不同发育阶段的营养组织与生殖组织中的表达状况;通过组织原位杂交的方法检测授粉受精后该基因的表达部位;构建了芜菁反义BcNAC2的植物表达载体,用中国白菜的变种菜心(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsenetLee)为材料进行遗传转化,通过遗传转化获得转基因植株,从分子生物学方面对转基因植株进行检测和分析。研究结果如下:(1)在已有的cDNA-AFLP差异片段的基础上,采用同源序列克隆技术获得与雌蕊发育相关的芜菁NAC转录因子——BcNAC2的cDNA和DNA序列全长。序列分析表明,BcNAC2的cDNA序列全长为2080bp,最大ORF框为1683bp,编码560个氨基酸序列。其DNA序列全长中包含6个外显子和5个内含子,外显子-内含子交接处序列遵循GT-AG的普遍规律,属于的剪接体识别序列。其中内含子的长度依次为67bp、102bp、269bp、81bp和83bp。对推导的氨基酸序列分析发现,该序列第9-159个氨基酸编码NAC结构域。利用SMART数据库进一步分析发现,其为NAM亚家族蛋白。BcNAC2的二级结构包含(文章此处忽略..)19.64%的α-螺旋,15.00%的p-折叠和65.36%的无规则卷曲结构,三级结构呈马鞍形。此外,与拟南芥的NAC2蛋白的功能结构域中的motif进行比较发现,芜菁BcNAC2与拟南芥AtNAC2功能结构域内的特征序列有显著的差异,主要区别在磷酸化位点上。在芜菁BcNAC2蛋白的NAC结构域内,发现有2个N-糖基化位点(79-82,103-106氨基酸),4个蛋白激酶C磷酸化位点(83~85,87-89,95-97,110-112氨基酸),5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(18~21,42~45,71-74,95-98,137~140氨基酸),2个N-酰基化位点(80~85,109-114氨基酸)。而在拟南芥NAC2蛋白的结构域中共发现有2个N-糖基化位点(57-60,79-82氨基酸),1个环腺苷酸和鸟苷酸依赖的蛋白磷酸化激酶(53~56氨基酸),3个蛋白激酶C磷酸化位点(42-44,61-63,72~74氨基酸),3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(30-33,37-40,72~75氨基酸),2个酪氨酸激酶磷酸化位点(11~17,11~18氨基酸),3个N-酰基化位点(4-9,58~63,85~90氨基酸)。由此可知,芜菁BcNAC2蛋白和拟南芥NAC2蛋白结构域内的特征序列差异较为明显,序列的差异是否会导致基因功能的不同,还需要后续进一步的研究。(2)从NCBI上搜索下载相关的30个NAC蛋白与芜菁BcNAC2进行同源比对,构建了分子进化树。结果表(本文此处忽略..)明,BcNAC2与拟南芥的AtNAC2、烟草的TERN和大豆的GmNAC6的亲缘关系较近,可以归为一类,均属于NAM亚家族。其中BcNAC2与AtNAC2的亲缘关系更近,说明同科植物的亲缘关系较近。通过对NAM亚家族的蛋白进行序列比对发现,在N端的NAC保守结构域处相似性较高,而在C端序列呈现多样性,同源性较低,表明不同的NAC转录因子可能通过不同的C-端序列调控转录活性,符合NAC转录因子的结构特点。(3)采用半定量RT-PCR分析和组织原位杂交等两种方法分析BcNAC2的表达特性。半定量RT-PCR分析了芜菁BcNAC2在芜菁不同发育阶段中的表达动态,发现该基因有组成型表达特点,其中在小蕾、中蕾中的表达量较高,而在授粉受精后的嫩角果中,授粉后8天的嫩角果表达量最高。该基因不仅在前期营养器官中能正常表达,而且在后期的种子或胚的形成过程中也有较高丰度的表达,暗示该基因在植物整个生长发育过程中都可能发挥着重要的作用。组织原位杂交分析结果表明,BcNAC2在授粉后4天胚珠的胚囊部位有较高的表达,而授粉8天的胚珠内部也有较高丰度的表达,上述(文章此处忽略..)结果与半定量的分析结果基本一致,由此推测,BcNAC2参与了种子或胚的发育形成过程。(4)在正确分离反义BcNAC2片段的基础上,构建了含有组成型启动子CaMV35S的反义RNA植物表达载体pBI35s-BcNAC2,并通过“冻融法”将其导入农杆菌,根据已建立的高效菜心遗传转化体系,利用农杆菌介导的方法将反义BcNAC2表达载体导入菜心中,目前已成功获得了6株KanR芽系,正对其可能的生物学功能进行进一步的研究。


以上为本篇毕业论文范文芜菁胚发育相关基因BcNAC2的功能分析的介绍部分。
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