酿酒酵母BY5419生产丙酮酸的定向进化及辅酶工程改造

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酿酒酵母BY5419生产丙酮酸的定向进化及辅酶工程改造

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毕业论文范文题目：酿酒酵母BY5419生产丙酮酸的定向进化及辅酶工程改造，论文范文关键词：酿酒酵母BY5419生产丙酮酸的定向进化及辅酶工程改造
酿酒酵母BY5419生产丙酮酸的定向进化及辅酶工程改造毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：丙酮酸是生物体内重要的代谢中间产物,参与机体糖类代谢、酯类代谢等,在细胞代谢过程中起着关键的枢纽性作用,联系着己糖二磷酸酯途径(HDP)与三羧酸循环(TCA)两大循环,许多代谢途径可以通过丙酮酸这一共同的中间产物而联系起来。日常中,丙酮酸及丙酮酸盐的用途极广,它是一类重要的有机化工中间体,可以用来合成多种化合物如氨基酸、维生素等；甚至可以用于生产杀菌剂、除草剂等；特别近年来人们发现,丙酮酸钙具有良好减肥效果,继而其研究也越来越热。丙酮酸的生产方法主要有化学合成法、生物催化法和生物发酵法。而常见的化学合成法,酶催化法合成具有原料难得、结构复杂、成本较高,不适于大规模生产,合成的丙酮酸酸多为外消旋混合物等缺点,因此利用微生（略..）物法合成丙酮酸酸成为发展趋势。酿酒酵母作为一种研究和应用最为广泛的真核微生物,发酵生产乙醇具有极好的优势。在厌氧条件和溢出代谢情况下,经糖酵解生成的丙酮酸几乎全部或大部分流向生产乙醇的支路,从而产生乙醇的积累；同时酵母细胞具有较高的耐受性,乙醇可以积累到较高浓度。通过合理利用产乙醇的代谢流向,将乙醇的代谢流引向丙酮酸的积累,为丙酮酸的生产提供了新的思路。利用酵母积累丙酮酸,首先要阻断乙醇支路的第一个作用基因丙酮酸脱羧酶基因(由PDC1／5／6编码),但是敲除PDC1／5／6后,改变了细胞内的代谢网络,导致细胞不能正常生长,主要表现为：(i)缺陷型菌株在葡萄糖限制的恒化条件下,在基本培养基上生长时,需要添加少量的乙醇或乙酸等二碳底物（本文此处忽略..）才能生长；(ii)在葡萄糖存在的基本培养基上,分批培养时,即使添加二碳底物,PDC缺陷型酵母菌株也不能生长。这就极大限制了PDC缺陷型酵母菌株代谢产丙酮酸的可利用性。针对PDC缺陷型酵母菌株,本文利用微生物细胞对生长环境的适应性,酵母细胞通过自身的突变然后经过自然选择作用,积累突变从而适应环境的能力,通过在摇瓶中一开始添加葡萄糖的情况下,通过二碳底物梯度减少的连续驯化培养,后期通过逐步增加葡萄糖浓度提高菌株高糖耐受性,筛选到一株可以较为正常生长且积累丙酮酸的菌株BY5419-A0,并进行初步发酵研究,确定了驯化菌株A0的发酵条件,在优化发酵条件下,丙酮酸可以积累到66.4g／L,产率为0.55gPyr/gGlc。驯化菌株虽然能在正常培养条（文章此处忽略..）件下生长,但仍极为缓慢,因而发酵周期相对较长。为了解决驯化菌株生长缓慢导致的发酵周期长的问题,我们利用辅酶工程的手段进一步对BY5419-Ao进行了分子改造。酿酒酵母细胞内,微量辅酶因子的变化就可能同时影响细胞内多个反应,从而引起细胞整体代谢的变化。酵母细胞代谢从葡萄糖到丙酮酸的过程,是氧化还原不平衡的,多余的NADH需要在细胞质内重新氧化,但酿酒酵母细胞质内重新氧化NADH的能力十分有限。为缓解酿酒酵母细胞细胞质内的氧化还原压力,可以引入外源的辅酶因子转化蛋白,进行辅酶因子的调控。本研究通过在驯化菌株BY5419-A0中表达外源性的辅酶调节基因：来源于L.lactisNZ9000的NADH水合氧化酶基因(noxE)和来源于E.coliJM（文章此处忽略..）109的转氢酶基因(udhA),来改善驯化菌株的生长及产酸情况。考虑到辅酶调节的微量性,即辅酶浓度的细小变化就可能导致细胞整体代谢的变化,本文构建noxE和udhA的系列启动子(GPD/GPD2/ADH1/TEF)的相关质粒,并采用不同拷贝数的质粒,调控量表达noxE和udhA基因,分别引入酿酒酵母驯化菌株BY5419-A0,然后进行发酵,检测辅酶调节的作用,获得了丙酮酸产量提高的酵母菌株：IAN-Ao(70.47g/L),2TN-A0(70.86g/L),1GU-A0(72.86g/L)1G2U-A0(74.83g/L).

以上为本篇毕业论文范文酿酒酵母BY5419生产丙酮酸的定向进化及辅酶工程改造的介绍部分。

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