基于荧光激活微液滴分选的脂肪酶/酯酶超高通量筛选体系

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基于荧光激活微液滴分选的脂肪酶/酯酶超高通量筛选体系

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毕业论文范文题目：基于荧光激活微液滴分选的脂肪酶/酯酶超高通量筛选体系，论文范文关键词：基于荧光激活微液滴分选的脂肪酶/酯酶超高通量筛选体系
基于荧光激活微液滴分选的脂肪酶/酯酶超高通量筛选体系毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：脂肪酶/酯酶是重要的工业用酶，在食品、精细化工、洗涤剂、医药、油脂、能源等工业领域有着广泛的应用。由于天然脂肪酶/酯酶存在稳定性差、对非天然底物活性低等缺点，通常需要进行改造才能满足工业应用的要求。蛋白质定向进化是重要的酶分子改造方法，在改善多种酶的活性、稳定性、底物选择性等方面已有很多成功的实例，其有效性与酶基因随机突变库的大规模筛选效率密切相关，而现有的筛选方法通量低、劳动量大以及筛选成本高，严重限制了定向进化技术的广泛应用。为了满足日益发展的酶工程领域（略..）对高通量、高通用性筛选方法的需求，本论文以脂肪酶/酯酶为模式体系，建立了基于荧光激活液滴分选（Fluorescence-activiteddropletsorting,FADS）原理的酶活性超高通量筛选体系。FADS酶活性高通量筛选体系是利用直径仅20μm左右的微液滴作为微反应器，将不同酶突变体的表达体系（细胞或无细胞表达体系）及荧光底物包裹其中进行反应，并利用流式细胞仪根据微反应器荧光信号的强弱进行高速分选的方法。该体系具有高灵敏度、高速度、耗费试剂少、通用性（文章此处忽略..）良好等优点，是进行酶活性高通量筛选最有潜力的方法之一。建立FADS脂肪酶/酯酶超高通量筛选体系需要满足一系列技术要求：（1）首先需要将目标酶分子展示在细胞表面以便酶与底物分子能够直接接触；（2）需要制备稳定的水-油-水二级微液滴作为微反应器的载体来实现酶基因型和表现型的偶联；（3）要调节微液滴中的细胞包裹量以实现较好的单细胞包裹；（4）要选择合适的酶催化底物，使产生的荧光产物分子在微反应器中有较好的保留性。本论文以来源于Archaeoglobusfulgidus的嗜（文章此处忽略..）热脂肪酶AFEST为模式体系，应用冰核蛋白表面展示体系实现了脂肪酶在大肠杆菌宿主中的展示表达；建立了膜挤出仪水-油-水二级微液滴生成方法，制备了稳定性良好、直径20μm左右的微液滴，适合进行FADS酶活性筛选实验；通过对微液滴中细胞包裹效率进行优化，确定了每1.5mL的二级微液滴体系中最佳细胞包裹量约为5×107个；考察了不同荧光分子在微液滴中的保留性能，最终选择荧光素衍生底物作为模式底物；最后进行了模式筛选实验，考察了不同阳性比例的样品在不同的分选阈值下的富集效率，最高富（文章此处忽略..）集效率可达到1000倍以上，证明了该体系的良好的筛选能力。此外，本论文还对FADS筛选体系的一些关键环节，如微液滴生成、微反应器中的酶反应以及流式分选等方面的实验技术进行了讨论。本论文建立的超高通量筛选体系可达到107以上的筛选通量，对脂肪酶/酯酶这一类重要工业用酶的研究将起到重要的推动作用。此外，该筛选体系具有良好的通用性，在有合适的表面展示体系及荧光底物的情况下，也可用于水解酶、氧化还原酶等酶类的筛选，具有较好的应用前景。

以上为本篇毕业论文范文基于荧光激活微液滴分选的脂肪酶/酯酶超高通量筛选体系的介绍部分。

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