大肠杆菌甘露糖异构酶（MI）基因克隆及功能研究

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大肠杆菌甘露糖异构酶（MI）基因克隆及功能研究

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毕业论文范文题目：大肠杆菌甘露糖异构酶（MI）基因克隆及功能研究，论文范文关键词：大肠杆菌甘露糖异构酶（MI）基因克隆及功能研究
大肠杆菌甘露糖异构酶（MI）基因克隆及功能研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：甘露糖异构酶(EC5.3.1.7)(Mannoseisomerase,简称MI)可以催化D-果糖和D-甘露糖之间的异构化反应,是生物法制备甘露糖生产中关键的酶,如用于甘露醇的工业生产,也能在一定程度上克服生产过程中山梨醇的伴生问题。因此,对该酶的研究具有广阔的应用前景。研究发现多种微生物均能产生甘露糖异构酶,包括嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)、黄单胞杆菌(Xanthomonas)、链霉菌(Streptomycesaerocolonigenes)、分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)和放射形土壤杆菌(Agrobacterae（本文此处忽略..）rogenes)等。但目前常用制备方法为从生产菌中直接提取,酶的产量不高,应用基因工程手段得到MI高产菌株具有重要意义。本实验从大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109中克隆到mi基因,并在E.coliBL21(DE3)中得到高效表达;进行了重组菌培养条件的优化;构建了mi酵母穿梭质粒,并在毕赤酵母(Pichiapastoris)X33中实现了分泌表达;对形成的大量包涵体蛋白进行了复性,这些都为酶法生产奠定了基础,主要结果如下:(1)克隆得到了E.coliJM109mi基因。采用PCR技术成功克隆到该基因,基因测序结果表明基因片段大小为1242bp,与报道的E.colistr.K（文章此处忽略..）-12substr.MG1655(U00096)、E.colistr.K12substr.DH10B(CP000948)、E.colistr.K12substr.W3110DNA(CP009048)一致性为99%,氨基酸序列一致性为99%;(2)构建了原核表达载体pET-mi。经诱导该基因能够在E.coliBL21(DE3)中进行高效表达,诱导出51.4kD的特异性融合蛋白条带。在37℃下反应1h,以甘露糖为底物测定的粗酶液的比活为10.34±0.087U/mg,以果糖为底物测定的粗酶液的比活为5.64±0.23U/mg;(3)构建了酵母穿梭质粒pGAPZ-mi,经测序知基因及载体上的分泌信号因子正确。通过化学转化LiCl法成功将此重组质粒转入PichiaX33中,通过抗性梯度纯化和筛选,得到了（略..）具有酶活的转化子,实现了组成型分泌表达。在调整的YPD(甘油取代葡萄糖)培养基中培养96h,后MI能分泌到发酵上清液中,以果糖为底物测定MI酶比活为5.94±0.07U/mg;(4)优化MI在E.coli中的诱导条件,增加可溶性MI的含量。确立了最佳条件为:当OD600为1.0时添加终浓度为10mmol/L的乳糖诱导,培养温度为18℃,转速为150r/min;(5)研究了酶的最佳反应温度、最佳pH和最佳底物等性质,确定最佳反应温度为37℃,最佳pH为7.5,最佳底物为甘露糖;(6)研究了MI包涵体复性的方式和复性影响因素,采用分步稀释法复性后用DEAE-SepharoseFastFlow层析柱进行回收和浓缩。复（略..）性条件为:复性液尿素终浓度为2mol/L,分步复性时间12h,GSH浓度为0.5mmol/L,c(GSH)/c(GSSG)为3,复性后MI的活性为3.14±0.11U,比活达到54.7±0.13U/mg,蛋白回收率达到20.6%。

以上为本篇毕业论文范文大肠杆菌甘露糖异构酶（MI）基因克隆及功能研究的介绍部分。

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