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高糖培养系膜细胞JAK_2/STAT_3信号转导通路活性的变化及对活性氧
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高糖培养系膜细胞JAK_2/STAT_3信号转导通路活性的变化及对活性氧
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高糖培养系膜细胞JAK_2/STAT_3信号转导通路活性的变化及对活性氧
高糖培养系膜细胞JAK_2/STAT_3信号转导通路活性的变化及对活性氧毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】
:近年来,世界范围内糖尿病(DM)的发病率明显上升。糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病,长期高血糖状态可导致肾脏组织损伤,功能障碍和衰竭。糖尿病肾病(DN)是DM患者致残和死亡主要原因之一。据统计我国DN年发生率高达30%,而据美国肾脏资料统计,约50%的终末期肾衰(ESRD)由糖尿病所致,并呈逐年上升趋势。但目前研究尚未完全探明DN的发生发展机制,亦缺少有效的防治措施。因此,进一步探讨DN发病机制并且寻找阻止DN进展的方法已成为国内外学者研究的热点问题。目前认为糖尿病肾病的发病过程中有多种酶和转录因子被激活,涉及多条细胞内信号转导通路(DAG/PKC、MAPK、JAK/STAT)杀伤靶器官,即高糖可以通过激活多种细胞内信号因子而导致靶器官损伤。其中Janns激酶/信号转导与转录激活子(Jamskinase/signaltransducersandactivatorsoftranscription,JAK/STAT)信号传导通路在近年来越来越引起人们的重视,大量研究表明,其与系膜细胞的增殖,肥大及细胞外基质分泌有关。但此信号通路与肾脏疾病的关系的报道尚不十分清楚目前的研究证实,氧化应激在糖尿(此处忽略..)病的发病过程中为一原发且独立的参与因素。活性氧簇(ROS)在糖尿病肾病(DN)的发生和发展过程中起着重要的作用,高糖可上调ROS,转化生长因子-β(TGF-β)在肾小球系膜细胞中的表达。ROS作为氧化应激的中心环节,参与DN的病理生理过程。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶通过其产生的ROS,可改变肾脏血流动力学,激活细胞内信号转导等,导致糖尿病肾病(DN)的发生、发展。然而,在DN时ROS是否能够通过调控JAK_2/STAT_3通路的活性而影响DN的病理生理过程,还有待于进一步研究。为此我们设计了以下实验:目的1.观察高糖培养大鼠肾小球系膜细胞(GMC)P-STAT_3的表达变化,并利用JAK_2阻断剂Ag-490阻断JAK_2/STAT_3通路,观察其对P-STAT_3表达变化的影响,探讨糖尿病状态下GMCJAK_2/STAT_3途径的活性变化。2.观察高糖培养大鼠肾小球系膜细胞在不同时间点下活性氧簇(ROS)产生的量的变化。3.通过NADPH氧化酶抑制剂(Apocynin)阻断ROS的产生,观察高糖培养下系膜细胞P-STAT_3的表达变化,探讨JAK_2/STAT_3通路与ROS之间的相互作用的影响。方法1.细胞(本文此处忽略..)培养:购买的大鼠肾小球系膜细胞株,选用DMEM培养基,在0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液消化并吹打均匀后,按1:3比例进行传代,3-5天传代一次2.分组:(1)GMC同步化后分成:正常糖浓度组(含糖5.5mmol/L);高糖浓度(25mmol/L);甘露醇组(5.5mmol/L糖+19.5mmol甘露醇);正常糖+AG-490(浓度10umol/L)组;高糖+AG-490(浓度10umol/L)组。继续观察培养24、48小时后用WesternBlot及细胞免疫化学方法检测系膜细胞STAT_3、P-STAT_3表达的变化。(2)GMC同步化后分成:正常糖浓度组(N,含糖5.5mmol/L);高糖浓度组(H,含糖25mmol/L);甘露醇组(M,含5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇);正常糖+Apocynin(N+A,Apocynin浓度为100umol/L);高糖+Apocynin(H+A,Apocynin浓度为100umol/L),分别于0、12h及36h收集上清液,用比色法检测系膜细胞产生ROS的量。(3)NADPH氧化酶抑制剂Apocynin预处理,GMC同步化后分为正常糖浓度组(N,含糖5.5mmol╱L);高糖浓度组(H,含糖25mmol/L);甘露醇组(M,含糖5.5mmol/L,甘露醇19.5mmol/L):正常糖+Ap(略..)ocynin(N+A,Apocynin浓度为100umol/L)组;高糖+Apocynin(H+A,Apocynin浓度100umol/L)组;Apocynin提前1小时加入,与正常糖或高糖共同培养GMC48小时,培养结束后,用WesternBlot方法检测系膜细胞P-STAT_3表达。3.检测方法:(1)用细胞免疫化学方法定性检测高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞STAT_3、P-STAT_3表达的变化。(2)用免疫印记法(WesternBlot)半定量检测高糖状态下大鼠肾小球系膜细胞STAT_3、P-STAT_3表达的变化。(3)用比色法检测高糖作用后培养系膜细胞上清液中ROS产生的水平。结果1.高糖培养大鼠肾小球系膜细胞在24小时和48小时P-STAT_3的表达较正常糖浓度组明显升高。甘露醇组与正常糖浓度组相比差异无统计学意义。而各组之间STAT_3表达差异无统计学意义。JAK_2阻断剂Ag-490可抑制高糖下P-STAT_3的表达,但对STAT_3表达无明显影响。2.高糖条件下,ROS产生明显升高,NADPH氧化酶抑制剂Apocynin可明显降低ROS的产生水平。3.高糖条件下,Apocynin经预处理后,在正常糖浓度和高糖浓度共同培养48小时,正常糖浓度(略..)组和正常糖+Apocynin组对比P-STAT_3的表达差异无明显差别;高糖+Apocynin组较正常糖浓度组P-STAT_3明显增加,但与高糖组相比P-STAT_3显著降低。结论1.高糖通过磷酸化方式激活大鼠肾小球系膜细胞(GMC)JAK_2/STAT_3信号转导通路,Ag-490可有效抑制GMCJAK_2/STAT_3信号转导通路活性的变化。2.高糖作用下,肾小球系膜细胞ROS产生增加,并具有时间依赖性,NADPH氧化酶抑制剂Apocynin可有效抑制ROS的产生。3.高糖激活JAK_2/STAT_3通路后,阻断ROS增加可部分抑制大鼠肾小球系膜细胞P-STAT_3的表达。
以上为本篇毕业论文范文
高糖培养系膜细胞JAK_2/STAT_3信号转导通路活性的变化及对活性氧
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