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绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究
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绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究
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绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究
绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】
:绿色木霉几丁质酶是一种内切几丁质酶,它能从几丁质链的内部切割β-1,4糖苷键,产生几丁寡糖。自然界每年生成的几丁质约有100亿吨,是地球上除了纤维素以外数量最多的有机化合物。目前,国内外对于几丁质酶的研究虽然取得了一定成果,但还没有产业化。分离新的几丁质酶基因并构建高效表达工程菌,对实现几丁质酶产业化具有十分重要的意义。本研究采用RT-PCR及PCR技术,从绿色木霉中分离内切几丁质酶基因ECH,并分析了该基因的cDNA序列,构建了原核表达载体,通过SDS-PAGE对该基因表达的蛋白产物进行了分析,用DNS法测定了重组菌产生的内切几丁质酶活力,在此基础上对该酶的生化性质进行了初步研究。另外,初步研究了重组菌产酶条件的优化。本研究主要取得了以下结果(文章此处忽略..):1.根据已克隆的内切几丁质酶基因序列的同源性比较,设计引物,采用PCR技术从绿色木霉基因组中分离出一个大小1467bp的特异DNA片段,采用RT-PCR技术从绿色木霉总RNA中分离出大小约1276bp的cDNA片段。序列对比后发现绿色木霉内切几丁质酶基因含有三个内含子,大小分别为52bp、69bp、64bp。2.对绿色木霉内切几丁质酶全长cDNA序列和已经报道的内切几丁质酶序列进行同源性分析,结果显示,该克隆片段与TrichodermaharzianumX79381.1、TrichodermavirideAF188924基因的同源性高达100%,与Trichodermasp.w512DQ462415.1、TrichodermavirideEF635427.1、AF208842.1、TrichodermaaureovirideAY850032.1和Trich(文章此处忽略..)odermahamatumU88560.1同源性高达95%以上。3.绿色木霉内切几丁质酶基因编码—酸性蛋白,等电点pI为4.95。预测编码蛋白的氨基酸序列含424个氨基酸残基,预测分子量为46kDa。绿色木霉内切几丁质酶蛋白164-172位氨基酸是几丁质酶18家族的活性位点,序列为FDGIDVDWE。用同源建模法模拟出绿色木霉内切几丁质酶的空间结构模型。4.根据测序结果,设计两对引物,扩增出带绿色木霉内切几丁质酶自身信号肽基因ECH和成熟的内切几丁质酶基因MECH。利用载体pET28a,构建原核表达载体pET28a-ECH和pET28a-MECH。经验证分析表明,所克隆的基因ECH和MECH已置于表达载体的正确阅读密码框下。5.包含pET28a-ECH和pET28a-MECH重组菌经诱导表达后经SDS-PAG(略..)E分析,蛋白的分子量均为42kDa。通过对表达载体pET28a-ECH和pET28a-MECH的SDS-PAGE几种参数包括时间、IPTG浓度诱导表达分析,结果显示pET28a-ECH最佳诱导时间为3h,pET28a-MECH诱导时间3-4h时表达量最高;pET28a-ECH最佳诱导IPTG浓度为1.0mmol/L。用DNS法对表达载体pET28a-ECH和pET28a-MECH产生的几丁质酶粗酶液的酶活进行初步测定发现,表达载体pET28a-MECH酶活高于pET28a-ECH。6.通过对重组几丁质酶的生化性质的研究发现,该酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH为7.0。酶的热稳定性不好,容易失活。添加低浓度(1.0mM)的金属离子Mg~(2+)、Ba~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)、Na~+对酶活力有(此处忽略..)促进作用,Ca~(2+)、Zn~(2+)、Co~(2+)对酶有抑制作用。另外,底物胶态几丁质的浓度对酶活测定也有很大的影响。7.通过对内切几丁质酶重组大肠杆菌的培养条件的研究发现,培养1h添加诱导剂1.0mmol/LIPTG,有利于酶活的提高。摇瓶培养中,5%的接种量最为合适,100mL装液量(500mL三角瓶)酶活最高。
以上为本篇毕业论文范文
绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究
的介绍部分。
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