图1：流动相为水时苹果酸的分离谱图
b  醋酸：
 苹果酸的保留时间很短或仍然无保留，无法分离。出峰混乱的另一原因可能是由于流动相中的醋酸本身在210nm有一定的紫外吸收，造成基线空白值很高，影响了其他物质的出峰。见图2。由于醋酸和水为流动相时不能确定几种酸的保留时间,所以没有进混合标样。

图2：流动相为醋酸时苹果酸的分离谱图
c 磷酸：
 延缓了3种有机酸的保留时间，也有很好的分离效果，见图3。根据酒石酸（图4），苹果酸（图5），柠檬酸（图6）的标样谱图，我们可以看出保留时间分别为2.107，（2.516，5.236），4.572的峰是酒石酸、苹果酸、柠檬酸的峰。

图3：流动相为磷酸时各种酸的分离谱图

图4：酒石酸标样的谱图（保留时间为2.123）

图5：苹果酸标样的谱图（保留时间为2.551，5.391）
 苹果酸标样经多次进样仍然为两个峰，根据参考文献，第一个峰（保留时间为2.551）是天然存在的L型苹果酸，第二个峰（保留时间为5.391）可能由于苹果酸原样品中含有苹果酸衍生物。所以选择苹果酸所出的第一个峰为定性和定量依据。

图6：柠檬酸标样的谱图（保留时间为4.648）
d  磷酸盐：
 可以看出酸的保留时间都相对提前了很多，而且分离效果不如磷酸，柠檬酸的峰（3.516）与苹果酸的第二个峰（3.786）没有分开。见图7：

图7：流动相为磷酸盐时各种酸的分离谱图
e  高氯酸与甲醇：
   高氯酸的分离效果和各种酸的保留时间与磷酸相似，见图8。但是考虑到高氯酸的强酸性影响柱子的寿命，所以本次实验最后选择了磷酸与甲醇为流动相。并且每次实验结束时分别用超纯水和甲醇冲洗30 min，以免损坏色谱柱。

图8：高氯酸为流动相时标样的谱图
3. 1.2   流动相中甲醇比例的选择
 实验中改变了三次流动相0.1％的磷酸溶液与甲醇的比，为90：10；95：5；97：3，发现当0.1％的磷酸溶液：甲醇＝97：3时，各种酸的分离效果最好，保留时间最长。但是考虑到柱对有机相（此次实验用的是甲醇）的最低5％的需求，本次实验仍然选用相比为95：5时的流动相。
 
3.1.3   流动相pH的选择
 在选定了磷酸为流动相后，分别配制pH为2.00(0.1%)和2.16(0.05%)的磷酸溶液，并以其作为流动相，测定同一混合标准溶液。结果表明，为使组分更好分离，选用pH=2.00的磷酸溶液最适宜。    本实验所测定的有机酸的解离常数接近，所以流动相pH对分离的影响十分重要。例如：第一个峰为酒石酸，pKa1=3.13、pKa2=4.77、pKa3=6.40，第三个峰为柠檬酸，其pKa1＝3.15、pKa2=4.11、pKa3=5.19。当流动相pH增大时，各种有机酸的保留时间减小，且不断接近，这是由于此时各种酸都电离后，在色谱柱上的保留减小，保留差异也减小。

3.2  波长的选择
 柠檬酸、苹果酸、酒石酸在210nm左右都有较强的吸收，灵敏度高，并且信号噪音比较好, 故确定检测波长为210nm。

3.3  标准样品及饮料样品色谱图：
 在最佳色谱条件下，分析有机酸标准液，酒石酸、苹果酸、柠檬酸结果的保留时间分别为2.107，（2.516，5.236），4.572。见图3。
 在最佳色谱条件下，饮料中3种有机酸的分离情况见图9－12。

图9：康师傅鲜的每日C苹果汁色谱图

图10：康师傅鲜的每日C葡萄汁色谱图

图11：三得利超级维体色谱图

图12：Scream色谱图
3.4  精密度和回收率
 本实验所使用测定回收率的方法用原样品和原标样等比例混合后再稀释的溶液来测定，使测定的试样本底不是和原样品或原标样很接近，造成的误差比较大。从表6结果中可以看出：当加入标样量和样品中有机酸含量相当时，回收率为104.0%，当加入标样量和样品中有机酸含量不是相当时，如加入的苹果酸标样为葡萄汁中的5倍数时，所引起的误差就会很大，所以加入标样量应与样品中有机酸含量相接近。本次测定的回收率虽在79.8%～139.3%之间，但根据上述分析，不能判断本方法测定回收率的准确度较低，只能说明加入标样量和样品中含量接近1:1时准确度较高。
表1  回收率测定结果
有机酸 加入标样(g/L) 葡萄汁中含量(g/L) 葡萄汁+标样(g/L) 回收率(%) 
酒石酸 0.1264 0.01164 0.1125 79.8 
苹果酸 0.1115 0.02963 0.1849 139.3 
柠檬酸 0.1129 0.1496 0.2670 104.0 
 
 从表5结果中可得：各种有机酸的根据峰高计算的相对标准偏差在0.05％～0.22％之间，重现性较好。
表2  方法的重现性试验结果
各次测定结果 1 2 3 4 5 平均值 相对标准偏差(%) 
酒石酸 0.01341 0.01120 0.01209 0.01164 0.01164 0.01253 0.12 
苹果酸 0.03177 0.02535 0.02963 0.02749 0.02749 0.02963 0.22 
柠檬酸 0.1467 0.1467 0.1482 0.1424 0.1453 0.1460 0.05 

3.4　线性范围和检出限
 用流动相稀释混合标准液，分别进样，以酸的浓度( g·ml )对峰面积A作线性回归见表； 以三倍信噪比值计算酒石酸，苹果酸，柠檬酸的检出限分别0.004740(g／L)，0.01115(g／L)，0.01270(g／L)。
表3 测定的线性关系
有机酸 线性范围 R2 回归方程 
酒石酸 0.00948～0.1896 0.9987 y = 1059x + 1.4940 
苹果酸 0.0223～0.446 0.9958 y = 569.56x + 4.0975 
柠檬酸 0.02541～0.5081 0.9971 y = 729.98x + 2.8745 

3.5  饮料中有机酸的测定

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