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系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析文库的构建及初步分析

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毕业论文范文题目:系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析文库的构建及初步分析,论文范文关键词:系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析文库的构建及初步分析
系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析文库的构建及初步分析毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】:第一部分系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析文库的构建目的:构建系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)文库方法:采集3个家族性系统性红斑狼疮患者外周血各5ml,混合在一起提取单个核细胞。采用三处改良的SAGE技术构建SAGE文库,三处改良分别为1)用交联有oligo(dT)25的磁珠直接抽提mRNA,并在同一反应管内进行双链cDNA的合成和NlaⅢ酶切,避免了原始SAGE方法中两次酚/氯仿抽提、乙醇沉淀造成的DNA损失。2)进行二次PCR扩增。即在第一次100bp标签扩增纯化后,再行一次短循环数的PCR扩增(文章此处忽略..),以获得足量的纯度相对较高的100bp标签。3)利用零背景的pZErO?-1质粒进行克隆,提高了效率。随机挑选237个转化菌克隆进行菌落PCR鉴定,以了解重组体是否转入转化菌及插入片段的大小。对部分阳性克隆进行测序,验证插入片段是否符合SAGE标签排列方式。结果:从3个家族性红斑狼疮患者外周血各5ml中共分离出1.6×106个单个核细胞。初步构建的SAGE文库已获得600个克隆,随机取237个克隆进行菌落PCR分析,其中216个克隆中质粒插入片段大于250bp,占91%。每个重组体中插入标签为数十个不等,以10-40个标签为多。对部分克隆测序证实插入的串联体序列为数百个碱基以CATG间隔,两个CATG之间约有20个碱基,其碱基序列排列方式符(此处忽略..)合SAGE标签排列。结论:对SAGE技术进行了改良,使之可应用于含RNA量少的组织或细胞。应用改良SAGE的技术成功构建了系统性红斑狼疮外周血单个核细胞SAGE文库,可了解系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达谱,并为筛选系统性红斑狼疮患者差异表达基因奠定了基础。第二部分系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析文库的初步分析目的:研究系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达模式。方法:构建系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析文库完成后,随机选取98个克隆进行大规模标签(tag)测序,得到的98个测序文件用SAGE2000V4.5软件分析其标签表达的特点。登陆http://www(略..).ncbi.nlm.nih.gov/SAGEmap网站,下载人类SAGE标签参考数据库,将初步获得的标签序列与人类SAGE标签参考数据库相比较,得到系统性红斑狼疮外周血单个核细胞的SAGE标签对应的基因信息。登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGEmap网站,将系统性红斑狼疮外周血单个核细胞SAGE文库中表达丰度位于前30的单配对标签提交查询,获得相对应的基因信息。结果:对98个克隆进行测序,获得1814个SAGE标签,由1286个序列不同的独立标签组成。这些标签中,单拷贝占86.6%,2-19拷贝占13%,仅0.2%的标签多于20拷贝。能与已知基因相配的标签占68.4%,其中41.1%能与多个基因匹配;31.6%的(文章此处忽略..)标签不能和已知基因配对,它们可能代表新基因。表达丰度为前三十的基因多为核糖体基因、参与细胞基本代谢的基因。结论:本研究勾画出SLEPBMCs基因表达概貌。更多标签的测序可获得完整的系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达谱,构建正常人外周血单个核细胞SAGE文库后,通过对比分析正常人和SLE患者的SAGE文库的生物学信息,将有助于筛选系统性红斑狼疮的差异表达基因。


以上为本篇毕业论文范文系统性红斑狼疮外周血单个核细胞基因表达系列分析文库的构建及初步分析的介绍部分。
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