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HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的实验研究

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毕业论文范文题目：HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的实验研究，论文范文关键词：HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的实验研究
HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的实验研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：研究背景我国事乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)感染的高风行区,个别人群的乙型肝炎病毒名义抗原(hepatitisBvirussurfaceantigen,HBsAg)阳性率为9.09%,跟着HBV疫苗纳入打算免疫,一些大城市HBV感染率已有所降落,但HBV感染仍然是影响人类健康的重大公共问题之一。HBV感染与肝细胞凋亡关联密切,CanbayA等认为在慢性HBV感染中,病毒为保持持续感染,宿主则为清除病毒而进行双方的较量,就病毒而言,在其增殖阶段,克制肝细胞凋亡,可使其在细胞内持续感染,大量繁殖;就宿主而言,细胞凋亡是限度病毒复制的天然细胞反应。凋亡细胞敏捷被吞噬而无毒性物质漏出时,不会产生炎症反应。但在病理前提下凋亡细胞数过多,超过吞噬细胞吞噬才能,凋亡细胞自发性裂解而内容物开释,将会导致炎症反应及组织伤害。在实际研究中,HBV感染与肝细胞凋亡之间的关联相称复杂,多种因素参加了肝细胞凋亡的调节,其中包含HBV病毒蛋白,目前研究较多的是HBx蛋白,对前C/C蛋白与肝细胞凋亡的关联研究较少。HBV全基因组前C/C区开放读框编码多种病毒蛋白,重要包含HBcAg(P21)、HBeAg(P17)、25kD(P25)蛋白、22kD(P22)蛋白等,其中HBV/P22蛋白是由P25蛋白在内质网上切割信号肽后生成,HBV/P22蛋白在细胞内组织蛋白酶作用下水解C-端肽段,构成17kD的HBeAg(P17)分泌到细胞外,但部分HBV/P22蛋白滞留于胞浆内。长期以来,人们认为HBV前C/C区蛋白对细胞不生物调（此处忽略..）控作用,近多少年的研究发明C区基因编码的核心抗原可能调控细胞内的基因表白。HBcAg能反式克制IFN-β基因转录,从而克制细胞内IFN蛋白的表白;它能反式克制MXA基因启动子活性,EMSA证明HBcAg与MXA基因启动子有直接彼此作用。在咱们的前期实验中,咱们通过构建HBcAg表白载体并筛选HepG2细胞克隆株进行研究,成果表明HBcAg表示为克制FasAb及IFNα引诱的HepG2细胞凋亡效应。HBV/P22蛋白含有核心抗原的全部氨基酸序列,因此该蛋白也可能参加克制细胞凋亡。TNFα在体内重要存在于肝脏中,约占全身30%,TNFα是重症肝炎发病的核心细胞因子之一,但体外研究表明,TNFα引诱肝细胞凋亡须要某些因素协同作用,即TNFα诱发细胞凋亡须要其余因素在转录程度进行阻拦。放线菌素D(Act-D)是一种RNA合成克制剂,Act-D处理后肝癌细胞对TNFα的刺激变得敏感,从而导致凋亡。有报道HBV/P22蛋白的AA23-73部分与Fas逝世亡结合蛋白(FADD)的逝世亡效应区(DED)有23.5%的同源性,FADD是TNFα引诱细胞凋亡的重要通路蛋白,因此HBV/P22蛋白可能通过影响Fas—FasL介导的凋亡道路,从而克制TNFα引诱的细胞凋亡。本研究通过体内、体外实验较为深刻的研究HBV/P22蛋白对肝细胞凋亡的影响。研究目标1、在体外实验中研究HBV/P22蛋白影响Act-D、TNFα引诱的HepG2细胞凋亡。2、在体内实验中研究HBV/P22蛋白影响Act-D、TNFα引诱的HepG2瘤体（此处忽略..）细胞凋亡。研究方法1、鉴定HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株牢固表白HBV/P22蛋白:HepG2-pCDNA3.1+、HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株分辨以1×10~6/孔接种于六孔板,3天后收集上清,雅培试剂检测HBeAg表白,HBeAg含量S/CO参考值2.1为阴性。前述两组细胞株分辨取10~7个细胞裂解,惯例方法进行HBV/P22蛋白的Westernblot检测。2、HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的体外研究:采取流式细胞术及原位末端标记技巧(terminaldeoxynucleotidemediatednickendlabelingTUNEL)检测HBV/P22蛋白影响Act-D、TNFα引诱的HepG2细胞凋亡。利用终浓度为333nMAct-D及1001μg/LTNFα引诱HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞凋亡,同时以HepG2-pCDNA3.1+细胞作为对比,刺激时光6h后,利用流式细胞术(FlowCytometry,FCM),利用AnnexinV-FITC双染色,检测细胞凋亡率;同样方法培养跟引诱细胞凋亡后,丙酮固定,样本通透性处理后,利用TUNEL技巧检测细胞凋亡率,DAB显色液显色,倒置显微镜下察看。阳性细胞断定标准:细胞核呈棕黄色染色为阳性,细胞核无棕黄色染色为阴性,随机取5个视线,高倍镜下(400×)察看记数阳性细胞百分率。3、裸鼠动物模型的树破:BALB/c-nu/nu裸鼠16只,随机分为2组。收集培养的HepG2-pCDNA3.1+跟HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞,以5×10~7/（本文此处忽略..）0.1ml/site细胞悬液分辨打针于裸鼠的颈背部皮下。瘤体积均匀值为100mm~3左右,利用Act-D、TNFα引诱瘤细胞凋亡,持续用药5天,每天一次。停药后第2天,处死裸鼠,收集瘤体标本,瘤体组织石蜡包埋,组织切片制造及HE染色察看瘤体状况。4、免疫组化检测肿瘤组织HBV/P22蛋白表白:石蜡切片抗原修复后,按免疫组化惯例步骤,用HBeAg单克隆抗体检测HBV/P22蛋白表白。DAB显色液显色,倒置显微镜下察看。阳性细胞断定标准:细胞呈棕黄色染色为阳性,细胞无棕黄色染色为阴性。5、TUNEL测定肿瘤组织细胞凋亡率:石蜡包埋的组织切片,按惯例方法进行脱蜡、水合、样本通透性处理后,按TUNEL试剂盒操作,DAB显色液显色,倒置显微镜下察看。阳性细胞断定标准:细胞核呈棕黄色染色为阳性,细胞核无棕黄色染色为阴性,随机取5个视线,高倍镜下(400×)察看记数阳性细胞百分率。成果1、鉴定HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株牢固表白HBV/P22蛋白:雅培分析检测示HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞培养上清HBeAg表白阳性,对比组为阴性;Westernblot检测显示HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞有HBV/P22蛋白表白,对比组为阴性。2、HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的体外研究:流式细胞术检测成果显示实验组细胞凋亡率(3.77±0.76)%明显低于对比组(23.31±5.82)%,(t=5.771,P=0.004);细胞TUNEL检测成果显示实验组细胞凋亡率(7.20±1.25)%明显低于对比组(15.28±1.48)%,(t=9.349,P=0.000)。3、裸鼠动物模型的树破:在（此处忽略..）豢养及用药过程中,HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞组裸鼠逝世亡2只,HepG2-pCDNA3.1+细胞组裸鼠逝世亡3只,每组取5只进行检测,HE染色察看瘤体状况良好。4、免疫组化检测肿瘤组织HBV/P22蛋白的表白:成果显示打针HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株的动物肿瘤组织有较好的HBV/P22蛋白表白,对比组为阴性。5、人肝癌肿瘤组织细胞TUNEL测定:TUNEL检测成果显示接种HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株的小鼠瘤体组织细胞凋亡率(16.73±1.52)%明显低于对比组(28.42±1.79)%,(t=11.121,P=0.000)。论断HBV/P22蛋白在体内外均可克制Act-D、TNFα引诱的HepG2细胞凋亡,其克制HepG2细胞凋亡的机理仍待进一步研究。

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