小鼠CD19胞外区基因和人组蛋白H1e C端基因的克隆及其原核表达

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小鼠CD19胞外区基因和人组蛋白H1e C端基因的克隆及其原核表达

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毕业论文范文题目：小鼠CD19胞外区基因和人组蛋白H1e C端基因的克隆及其原核表达，论文范文关键词：小鼠CD19胞外区基因和人组蛋白H1e C端基因的克隆及其原核表达
小鼠CD19胞外区基因和人组蛋白H1e C端基因的克隆及其原核表达毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：CD19分子是B淋巴细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,也是B淋巴细胞表面重要标志之一。CD19是CD19/CD21/CD81信号复合体中一个成分,信号复合体可调节BCR刺激活化的阈值,其中CD21(CR2)结合BCR上的补体C3片段,使CD19与BCR交联,促进B细胞激活,这种作用对于B细胞初次应答尤为重要。CD19胞膜外区参与了与CD21和CD81的相互作用,CD19的跨膜区也参加了与CD21和CD81的相互作用。CD19胞浆区可与PI-3K,Vav以及Src家族中Lyn,Fyn激酶相结合。首先根据GenBank登录的小鼠CD19基因序列设计一对引物,通过反转录-聚合酶链式反应(Reversetranscription-polymerasechaieaction,RT-PCR)技术,从小鼠脾脏组织总RNA中扩增出一条特异性基因片段,经单酶切鉴定,与GenBank中登录的小鼠CD19基因序列含有相同的单酶切位点。PCR产物分离纯化后连接到pGEX-4T-1载体,经（本文此处忽略..）菌液PCR筛选出阳性重组克隆后进行序列测定。结果表明本实验成功的克隆到CD19基因的胞膜外区片段,由918个核苷酸组成,编码306个氨基酸。所克隆的小鼠MECD19基因与GenBank中登录的小鼠CD19基因相比较,有6个核苷酸的差异,同源性为99.7%。其次,将原核表达重组质粒pGEX-4T-1-MECD19转化到大肠杆菌BL21,经37℃和1.0mmol/LIPTG的诱导,SDS-PAGE凝胶电泳表明所克隆的基因片段在大肠杆菌中得到融合表达,表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与MECD19的融合蛋白GST-MECD19,且表达的产物主要以包涵体的形式存在。所获得的融合蛋白分子量分别约为59KD,与预期结果相符。最后,通过优化原核表达条件,确定了原核表达重组质粒pGEX-4T-1-MECD19的最佳诱导时间和诱导剂浓度后,对含有pGEX-4T-1-MECD19质粒的BL21菌进行了大量诱导表达,实验中使用反复冻融和超声方法来裂解诱导表达菌,获得了较高浓度的GS（本文此处忽略..）T-MECD19包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性GST-MECD19原核融合表达蛋白。综上所述,本研究成功地克隆了小鼠CD19基因的胞外区片段,并进行了原核表达,获得了大量的GST-MECD19原核融合表达蛋白,这些都为进一步研究小鼠CD19分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。组蛋白是真核生物染色体(质)中含量最高的结构蛋白,其总量与染色体DNA大致相等。组蛋白属于碱性蛋白质,等电点一般在pH10.0以上,能与带有负电荷的DNA分子紧密结合。按组成中精/赖氨酸的比例,组蛋白可被分为五种:H1、H2A、H2B、H3、H4。H1组蛋白由220个氨基酸组成,分子量较大,进化中不如其它组蛋白那么保守,哺乳类细胞的组蛋白H1约有8种密切相关的,氨基酸系列上稍有不同的亚型,H1组蛋白在构成核小体时起连接作用,可赋予染色质以极性,与核小体包装成更高一级结构的过程相关。首先根据GenBank登录（本文此处忽略..）的人组蛋白HistlH1e基因序列设计一对引物,先通过提取人基因组DNA,再利用PCR技术,从人基因组DNA中扩增出一条特异性基因片段。PCR产物分离纯化后连接到pET-32a载体,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆后进行序列测定。结果表明本实验成功的克隆到人组蛋白H1e基因的C末端区域,由435个核苷酸组成,编码145个氨基酸。所克隆的人组蛋白H1eC基因与GenBank中登录的人组蛋白H1e基因相比较,同源性为100%。其次,将原核表达重组质粒pET-32a-H1eC转化到大肠杆菌BL21,经37℃和1.0mmol/LIPTG的诱导,SDS-PAGE凝胶电泳表明所克隆的基因片段在大肠杆菌中得到融合表达,表达出含有HisTag与人组蛋白H1e基因的融合蛋白His-H1eC,且表达产物主要以包涵体的形式存在。所获得的融合蛋白His-H1eC分子量约为36KD,与预期结果相符。最后,通过优化原核表达条件,确定了原核表达重组质粒pET-32a-H（本文此处忽略..）1eC的最佳诱导时间和诱导剂浓度后,对含有pET-32a-H1eC质粒的BL21菌进行了大量诱导表达,实验中使用反复冻融和超声方法来裂解诱导表达菌,获得了较高浓度的His-H1eC包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性His-H1eC原核融合表达蛋白。综上所述,本研究成功地克隆了人组蛋白H1e基因的C末端区域,并进行了原核表达,获得了大量的His-H1eC原核融合表达蛋白,这些都为进一步研究人组蛋白H1e分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。

以上为本篇毕业论文范文小鼠CD19胞外区基因和人组蛋白H1e C端基因的克隆及其原核表达的介绍部分。

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