谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建及发酵初步研究

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谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建及发酵初步研究

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毕业论文范文题目：谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建及发酵初步研究，论文范文关键词：谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建及发酵初步研究
谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建及发酵初步研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：L-色氨酸是8种必须氨基酸之一,具有重要的生理功能,应用范围非常广泛,但由于其产量低、价格高,难以满足市场需求,因此开展L-色氨酸育种方面的研究工作具有重要意义。本课题选取的出发菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)SPT9(Phe~-、Tyr~-、4-FP~r、6-FT~r)是一株通过传统诱变方式得到的解除了芳香族氨基酸反馈抑制和反馈阻遏并带有L-苯丙氨酸、L-酪氨酸双营养缺陷型标记的菌株。为了增加该菌株L-色氨酸合成的代谢流,对关键酶基因aroⅡ和trpEGD进行了克隆和过量表达,并对丙酮酸激酶基因(pyk)进行了敲除。（文章此处忽略..）本课题的目的在于结合基因工程育种和传统诱变育种各自的优势,得到一株具有工业应用前景的产L-色氨酸菌株。具体研究内容包括:1、建立了检测发酵液中L-色氨酸含量的高效液相色谱分析方法,得到优化的HPLC条件如下,流动相配比:甲醇:0.02mol/L乙酸钠缓冲液(pH=4.5)=30:70,流动相流速:0.8mL/min,检测波长:280nm,进样量:10μL。在该色谱条件下,色氨酸能有效地与发酵液中的其他成分分离,并且使色氨酸的保留时间由初始条件下的12min提前到4min左右,提高了分析效率。2、采用PCR方法从菌株SPT9中扩增到解除了反馈抑制的aroⅡ和trpEGD基因,并应用大肠（文章此处忽略..）杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-XK99E在菌株SPT9中对这些基因进行了分别过量表达和串联过量表达。得到的菌株SPT9-aroⅡ、SPT9-trpEGD、SPT9-trpEGD-TP-aroⅡ的色氨酸产量相对于出发菌株SPT9分别提高了30%、23%、84%。荧光定量PCR检测表明,菌株SPT9-trpEGD-TP-aroⅡ中aroⅡ、trpEGD的转录水平分别为出发菌株SPT9的4.0倍和1.3倍。3、以菌株SPT9的基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR扩增出丙酮酸激酶基因(pyk)中间序列缺失的序列,并将其与载体pk18mobsacB连接构建基因敲除载体pk18mobsacB-Δp（此处忽略..）yk。将此载体用于菌株SPT9中pyk基因的敲除,得到的pyk基因缺失的菌株SPT9-Δpyk,其色氨酸产量为0.27g/L,较出发菌株SPT9减少了10%。荧光定量PCR检测表明,菌株SPT9-Δpyk中的pyk基因没有转录(其转录水平仅为出发菌株SPT9中pyk基因的0.002倍)。4、通过单因素实验和正交试验对菌株SPT9-trpEGD-TP-aroⅡ产色氨酸的发酵条件进行了优化,确定该菌产色氨酸的最佳接种量为1%、装液量为10mL、发酵培养基初始pH值为7.0,最佳发酵培养基组成为:葡萄糖6%,硫酸铵3%,玉米浆1%,磷酸氢二钾0.025%,磷酸二氢钾0.025%,MgSO_4·7H_2O0.025%,MnSO_4·7H_2O10mg（文章此处忽略..）/L,CaCO_32%。在优化后的发酵条件下,菌株SPT9-trpEGD-TP-aroⅡ的色氨酸产量为0.79g/L,相对于初始条件下的0.55g/L提高了44%。在发酵过程中,菌株SPT9-trpEGD-TP-aroⅡ相对于出发菌株SPT9耗糖速率减慢,菌体生长速率减慢、稳定期所达到的菌体浓度减小。

以上为本篇毕业论文范文谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建及发酵初步研究的介绍部分。

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