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基于thyA基因的染色体—质粒平衡致死系统的构建

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毕业论文范文题目:基于thyA基因的染色体—质粒平衡致死系统的构建,论文范文关键词:基于thyA基因的染色体—质粒平衡致死系统的构建
基于thyA基因的染色体—质粒平衡致死系统的构建毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】:目前,外源基因表达载体多以抗生素抗性基因作为选择标记,对于基因治疗和基因免疫用表达载体,这些抗性标记基因的存在有可能引起一系列生物安全性问题。因此,需用更为安全的非抗生素抗性标记表达载体,其中染色体-质粒平衡致死系统具有广泛的应用前景。为了构建用于动物基因治疗和基因免疫的非抗性标记表达载体,我们将DH5α大肠杆菌在含有胸腺嘧啶核苷和(本文此处忽略..)3-甲氧2-氨嘧啶的CBT培养基上进行选择培养,筛选得ThyA-突变株21株。这些突变株在不含胸腺嘧啶核苷的CB琼脂平板上不生长,只有在添加胸腺嘧啶核苷的培养基或转化thyA表达载体后才能在正常培养基生长。为了研究thyA基因突变的分子机理,用高保真PCR法克隆4个突变株的thyA基因,序列分析结果显示,4、7、13号菌株在70位碱基起有6个碱基缺失,导(略..)致25位甘氨酸和26位苏氨酸的缺失;6号突变株在92位碱基由G突变为A,导致31位甘氨酸被天冬氨酸替换。用PCR克隆野生大肠杆菌的ThyA基因,将其克隆入原核表达载体,用重组大肠杆菌表达的重组蛋白免疫小鼠,用获得的抗血清进行免疫转印试验,结果发现突变株的ThyA基因仍能表达。根据鼠伤寒沙门氏菌菌株thyA基因序列设计一对引物,用PCR扩增包括启动子(此处忽略..)的thyA基因,将序列正确的基因取代表达人溶菌酶基因的真核载体pcDNAKLYZ中的卡那抗性基因,获得非抗性选择标记表达载体pDTALYZ。将其转化ThyA-DH5α大肠杆菌,转化菌涂布不含胸腺嘧啶核苷的CB平板,筛选得非抗性标记重组大肠杆菌。在CBt液体培养基传20代未发现质粒丢失,酶切鉴定正确。将pcDNAKLYZ重组菌和pDTAL(文章此处忽略..)YZ重组菌在相同条件下,以普通的LB为培养液进行高密度发酵培养,发现两种重组菌的生长曲线无明显差异;发酵结束后,定量取样提取质粒DNA和进行定量测定,结果显示两种重组菌的质粒产量无差异;定量取样分别在普通和选择培养基上培养,发现两种重组菌的质粒丢失率分别为38.1%和15.7%。


以上为本篇毕业论文范文基于thyA基因的染色体—质粒平衡致死系统的构建的介绍部分。
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