应用蛋白质工程技术改变嗜热酯酶的底物选择性

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应用蛋白质工程技术改变嗜热酯酶的底物选择性

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毕业论文范文题目：应用蛋白质工程技术改变嗜热酯酶的底物选择性，论文范文关键词：应用蛋白质工程技术改变嗜热酯酶的底物选择性
应用蛋白质工程技术改变嗜热酯酶的底物选择性毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：酯酶(EC3.1.1.3)能够催化酯键或类酯键(羧酯酶、硫酯酶、酰胺键)的水解,产生有机酸和醇,因此在食品、医药和化工等领域具有重要应用价值。来源于嗜热古菌AeropyrumpernixK1的酯酶APE1547具有超常的生物学稳定性,并对系列对硝基苯酚酯底物表现良好的酯酶水解活性,底物最适酰基链长为C8。前期研究工作表明:对活性部位保守残基R526的饱和突变能有效提高酯酶活性,但不改变对底物酰基链长的选择性。为进一步提高该（此处忽略..）酶对长链酰基底物的选择性,我们从最佳突变体R526V出发,应用定向进化和半理性设计途径对酶进行分子改造,获得了以下实验结果:(1)采用易错PCR对编码催化结构域的基因进行随机突变,构建突变库并对其进行高通量筛选,从近万株菌种中筛选得到突变体R526V/T560W(简称VW),其水解长链酰基底物pNPC12的活力相对于APE1547/R526V提高约1.4倍。(2)以APE1547的晶体结构分析为基础,在保留关键的催化和‘氧洞’残基基础上,选择距底物口袋（此处忽略..）5?范围以内的11个氨基酸残基,对突变体VW进行单点饱和突变研究。分析活性分布数据发现:位点W474和F488对底物的酰基链长选择性有显著影响。(3)通过高通量筛选,获得三个底物选择性发生明显变化的突变体:F488G/VW、W474V/VW和W474V/F488G/VW。酶催化动力学分析表明,他们对长链酯底物pNPC12的kcat/Km值分别是R526V的4.46倍、20.9倍、22.5倍。应用计算机建模和底物对接实验对突变体性质变化的原因进行了分析,488位点位于底物（本文此处忽略..）结合口袋的侧壁,当488位点残基由Phe突变为小侧链残基Gly后,扩大了底物结合口袋体积,推测更利于容纳长链酰基;474位点位于底物口袋的底部,当该位点残基由芳香族侧链Trp突变为Val后,底物结合口袋的深度由6.07?延长为11.4?左右,有利于长链酯底物的进入与定位,因而提高了活性。有趣的是,我们发现这些突变体在12%(v/v)乙腈体系中对pNPC12的活力显著提高,而野生型活力没有提高,并表现60%的抑制,说明突变改变了活性部（略..）位的微环境,乙腈有利于催化反应的进行。本论文应用蛋白质工程技术提高了嗜热酯酶APE1547的底物选择性,探讨了其活性和底物选择性的调控机制,为其工业应用奠定了基础。

以上为本篇毕业论文范文应用蛋白质工程技术改变嗜热酯酶的底物选择性的介绍部分。

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