基于穿透肽技术的高通量多肽药物筛选系统的建立

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基于穿透肽技术的高通量多肽药物筛选系统的建立

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毕业论文范文题目：基于穿透肽技术的高通量多肽药物筛选系统的建立，论文范文关键词：基于穿透肽技术的高通量多肽药物筛选系统的建立
基于穿透肽技术的高通量多肽药物筛选系统的建立毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：炎症(inflammation)是一种广泛的病理生理反应，参与多种疾病的发生和发展，如脓毒血症、系统性炎症反应综合征、缺血再灌注损伤等常常伴随剧烈的急性炎症反应。慢性炎症是类风湿关节炎、慢性骨病、慢性炎性肠病、脂肪沉积性动脉粥样硬化、以及某些癌症的主要病因。积极治疗和控制炎症是多种疾病治愈的关键。目前，有许多针对炎症治疗的生物制剂，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)的特异性抗体、自由基清除剂、蛋白酶抑制剂、黏附分子抗体等，这些药物虽然在细胞和动物实验中取得了一定疗效，但临床应用都未达到理想疗效。因此，当前迫切需要寻找和研制更加有效的治疗炎症的药物。炎症的一个重要特征是其发生和发展过程中会激活大量炎症相关因子基因的表达，如趋化因子、黏附分子、细胞因子、蛋白酶、环氧合酶(cyclooxygenases，COX)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)等。细菌的代谢产物LPS以及主要的致炎细胞因子(IL-1，TNF-α)作用于机体细胞时，通过细胞表面特异性受体的介导可将信号传递入细胞内，通过调节炎症过程中（文章此处忽略..）众多基因的表达，引发大量炎性因子的释放。虽然激活释放的炎性因子的数量非常庞大，但是在激活炎性因子基因表达过程中的上游信号转导通路却是相对有限的，所以，这就提示我们如果针对这些信号转导通路中的特定信号分子为药物靶点，通过调节它们的活性来抑制炎性基因的表达，就可以有效的控制炎症的发生和发展。在生物体内调节某一生物大分子功能活性的方式有很多种，但最有效的途径是通过直接干预其基因表达的过程。基因表达调控的基本形式是通过蛋白质—DNA、蛋白质—蛋白质间的相互作用来实现，而蛋白质的作用往往是由组成其结构的多肽的功能来体现。因此，近年来利用功能性多肽模拟蛋白质的功能作为药物进行治疗成为一种新趋势。我们设想在体外将一些功能性多肽运送入培养的真核细胞中，通过研究这些多肽对炎症中特定信号转导分子基因表达的调控作用，寻找和筛选新的抗炎多肽，进而为炎症治疗提供新的供选药物，为炎症相关疾病的发生机理提供理论和实验依据。但是要实现上述目的，必须解决以下几个问题：(1)必须有一种工具能有效的携带外源的多肽进入细胞内，而又不影响细胞的形态和功能。(2)多肽进入细胞后，能够通过核膜上的核孔复合体进入细胞核。(3)有一种简捷、方便、有效的手段来观察和研究多肽在细胞内的行为。(4)能够以一种简便、经济的方式（此处忽略..）得到研究所需的可供筛选的候选多肽。为了满足上述实验研究的要求，我们利用点突变PCR技术在本室已有的两个原核表达载体pET14b-His-EGFP、pET14b-His-MCStop／EGFP的基础上引入来源于Kaposi肉瘤成纤维细胞生长因子(Kaposifibroblastgrowthfactor，K-FGF)信号肽疏水区的称为膜穿透序列／膜转位序列(membrane-permeable／translocationsequence，MPS／MTS)的细胞穿透肽(cellpenetratingpeptide，CPP)序列、SV40大T抗原的核定位信号序列(nuclearlocalizationsequence，NLS)，分别构建了细胞穿透肽位于融合蛋白氨基末端和羧基末端的两个靶向细胞核运输的蛋白表达载体。经酶切、测序验证载体构建正确后，将质粒转化入BL21(DE_3)表达菌株，表达纯化后得到融合蛋白，然后将融合蛋白直接加入培养的真核细胞，利用荧光显微镜观察和Westernblot检测对融合蛋白的细胞转导功能及内化行为进行研究。结果发现细胞穿透肽位于融合蛋白氨基末端和羧基末端的两个融合蛋白均可以有效的进入细胞内，并且对细胞的毒性非常小。融合蛋白内化后细胞内定位的动态观察表明，荧光标记的（本文此处忽略..）融合蛋白在加入细胞15min后就可以穿透细胞膜到达细胞内，荧光起始主要分布于细胞质中，然后随时间的延长逐渐向细胞核转移，但融合蛋白内化后入核布完全，有部分蛋白停留在核周与胞浆。对其运输动力学的检测结果显示，它们的内化存在浓度依赖效应，随融合蛋白浓度的增加而增加；在时间上也存在一定的依赖关系，起始随时间的延长而增加，至3h达高峰，随后又逐渐下降。在验证了靶向细胞核运输的细胞穿透肽融合蛋白具有高效的转导功能，并获得其蛋白转导动力学方面的一些数据后，我们再次使用点突变PCR技术将编码12个氨基酸的36个寡核苷酸组成的随机序列引入构建好的蛋白表达载体中，构建了可编码12个氨基酸的随机多肽表达文库，并初步估计随机肽库的库容约为1×10~6。然后从平板上随机挑取14个单克隆进行了快速菌液PCR鉴定，通过对PCR结果的分析，判断随机多肽插入的情况。进一步从菌液PCR鉴定为阳性的单克隆中抽取若干个，进行DNA测序分析，对随机肽序列组成的基本框架和多样性进行了评价。结果表明，随机序列插入成功，其组成框架与预先引物设计NNK(N=A+G+C+T，K=G+T)模式基本相符，涵盖了多样的氨基酸排列形式。通过以上实验我们得出如下结论：1．本研究中基于细胞穿透肽技术，利用核定位信号的功能，将两者的作用相结合，（此处忽略..）成功构建了可以靶向细胞核进行运输的蛋白表达载体。为运输外源蛋白、多肽及药物进入细胞提供了一种经济、有效的工具。2．本研究表明，细胞穿透肽的位置对融合蛋白的原核表达会有一定影响，在氨基末端时，融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在，而在羧基末端时有高水平的可溶性表达，这提示我们，在实际中应用细胞穿透肽进行物质运输时，一定要尽可能详细的考虑其在融合蛋白中的位置，才能更好的发挥它们的功能。3．细胞穿透肽的位置对融合蛋白内化后的入核过程没有明显影响，引起细胞穿透肽入核不完全的机制有待进一步研究。4．成功构建了可以编码12个氨基酸的随机多肽表达文库，在库容和多样性方面均可以满足筛选的要求，为下一步进行抗炎多肽的筛选奠定了基础。综上所述，本研究从“组学”的角度出发，注重真核细胞基因表达调控的复杂性、网络性等特点，基于炎症中信号转导分子为靶点进行药物筛选的思路，利用分子、细胞水平药物高通量筛选的理论，初步建立了基于细胞穿透肽技术的可供高通量筛选多肽药物的技术系统，为筛选新的抗炎药物和炎症相关疾病的治疗及预防提供了有效的技术支持。

以上为本篇毕业论文范文基于穿透肽技术的高通量多肽药物筛选系统的建立的介绍部分。

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