人肺SP-A的提取、纯化及抗人SP-A mAb制备和初步应用研究

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人肺SP-A的提取、纯化及抗人SP-A mAb制备和初步应用研究

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毕业论文范文题目：人肺SP-A的提取、纯化及抗人SP-A mAb制备和初步应用研究，论文范文关键词：人肺SP-A的提取、纯化及抗人SP-A mAb制备和初步应用研究
人肺SP-A的提取、纯化及抗人SP-A mAb制备和初步应用研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目的：1、从人肺支气管肺泡灌洗液(BALF)中提取高纯度、高活性的肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)；2、采用提取的SP-A作为抗原免疫BALB/C小鼠，制备抗人SP-A单克隆抗体。3、利用筛选出的单克隆抗体组合进行夹心ELISA检测标本中SP-A含量，为制备SP-A快速检测试剂盒作准备。方法：1、捐赠健康尸肺2个，生理盐水反复灌洗4次收集支气管肺泡灌洗液，500×g离心15分钟去除细胞碎片后，10000×g离心40分钟收集沉淀，沉淀溶解于6M的尿素，SP-A蛋白重新复性后上清过maltosyl-agarose柱进行亲和层析，用梯度EDTA洗脱SP-A，并过surpose6柱纯化。最终SP-A产物经SDS-PAGE和Westernblotting鉴定。2、采用提取纯化的SP-A加弗氏（文章此处忽略..）佐剂充分乳化后腹腔注射免疫5只BALB/C小鼠，每1周1次，共免疫次，第四次采用纯抗原脾内直接注射。融合前3天静脉注射纯抗原免疫冲击。处死后取脾制备脾细胞悬液与对数生长期小鼠SP2／0骨髓瘤细胞融合，融合剂为50％PEG3500。HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，2周后改用HT培养基。间接ELISA筛选阳性分泌克隆，有限稀释法亚克隆3次，获得能稳定分泌SP-AmAb的单克隆杂交瘤细胞株。反复冻融复苏分泌活性稳定。将此杂交瘤细胞接种于BALB/C小鼠腹腔，7～10天后处死采集腹水，采用盐析法提纯腹水中SP-AmAb，间接ELISA检测抗体活性，并用Westernblotting进一步鉴定。采用Sigma鼠单克隆抗体分型试剂盒测定其亚型。3、采用非竞争酶免疫实验检测提取单克隆（此处忽略..）抗体的亲和常数。选择亲和力常数高的3株SP-AmAb两两配对，其中二抗标记辣根过氧化物酶，进行夹心ELISA，检测样本中SP-A浓度，筛选出最佳抗体配对组合。结果：1、采用maltosyl-agarose柱层析法从两个尸肺BALF中共提取获得高纯度SP-A40mg。聚丙烯酰胺电泳在36kda和70kda处可见清晰条带，在分子量118kDa以上亦可看到3条清晰条带，经westernblotting鉴定均为特异性SP-A蛋白。2、免疫4次后抗原静脉冲击前眼眶取血测效价为1/128000，融合前效价为1/256000。融合率约80%，阳性克隆率约85%。共筛选获得高分泌活性的单克隆杂交瘤细胞株n株(IB6D9EIC2，ICIE7E7DZ，IB6D7D3C6，IB6B4F7G9，IA5F6H2D5，ID5G9C10H3，ICIE9D3G5，2F2F5E9D4，2FllD3C2A（本文此处忽略..）8，2B6C4F6E7，2B6C4E2HI)，检测其中效价较高的5株(IB6D9EIC2，ICIE7E7D2，IB6D7D3C6，IB6B4F7G9，IASF6HZDS)亚型，2株为工gGI、3株为IgGZb。经反复冻存复苏抗体分泌活性稳定。3、将单克隆杂交瘤细胞株n株中5株接种于BALB/C小鼠腹腔，每株3只小鼠，共收集腹水58ml。经硫酸胺盐析法提取纯化获得抗体蛋白共154.56mg。5株抗体亲和常数均较在10狱一‘以上。3株亲和力高的抗体(IB6D9EIC2、IB6D7D3C6、IASF6HZDS)两两配对，进行夹心ELISA，检测不同浓度的SP一A标准品，检测灵敏度可达到IOng水平。结论:1、采用maltosyl一agarose柱层析法从人肺支气管肺泡灌洗液中可以提取获得大量高纯度、高活性的SP一A。与传统的OGP提取法相比，具有提取量（此处忽略..）大，纯度更高，活性保存良好的优点。2、采用自行提纯的SP一A免疫小鼠，可成功获得高分泌活性、高特异性的抗人SP一A单克隆杂交瘤细胞株。3、采用制备纯化的鼠抗人SP一AmAb进行夹心ELISA检测样本中SP一A浓度，具有灵敏度高，准确度高，特异性好的优点。为下一步制备可供实用的SP一A检测试剂盒奠定了基础。

以上为本篇毕业论文范文人肺SP-A的提取、纯化及抗人SP-A mAb制备和初步应用研究的介绍部分。

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