日本血吸虫信号蛋白14-3-3的免疫诊断及虫卵cDNA文库的构建

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日本血吸虫信号蛋白14-3-3的免疫诊断及虫卵cDNA文库的构建

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毕业论文范文题目：日本血吸虫信号蛋白14-3-3的免疫诊断及虫卵cDNA文库的构建，论文范文关键词：日本血吸虫信号蛋白14-3-3的免疫诊断及虫卵cDNA文库的构建
日本血吸虫信号蛋白14-3-3的免疫诊断及虫卵cDNA文库的构建毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目的:诱导表达本室保种的含有日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)编码基因的重组表达载体pET28a(+)-Sj14-3-3,制备并纯化出重组蛋白Sj14-3-3(rSj14-3-3),建立重组抗原间接ELISA方法(rSj-ELISA)诊断日本血吸虫病,并与日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SjSEA)的间接ELISA、间接血凝试验(IHA)和环卵沉淀试验(COPT)平行检测,比较几种方法的敏感性和特异性之间的差异,以探讨重组抗原用于诊断血吸虫病的实用性和可靠性。方法:诱导含Sj14-3-3编码基因的重组质粒pET28a(+)-Sj14-3-3表达出rSj14-3-3。SDS-PAGE和Westernblotting验证表达量和免疫活性,使用亲和层析法纯化重组蛋白,并用Bradford法检测纯化蛋白的浓度。将rSj14-3-3和SEA包被反应板,棋盘滴定分别确定最适抗（略..）原包被量和血清稀释度,建立rSj-ELISA和SEA-ELISA诊断日本血吸虫病方法。用rSj-ELISA,SEA-ELISA,SEA-IHA和COPT四种方法平行检测急性日本血吸虫病患者64例,慢性日本血吸虫病患者56例,华支睾吸虫患者28例,肠道线虫患者以及正常人血清各32例,比较不同方法之间敏感性,特异性以及交叉反应性。结果:诱导表达重组质粒pET28a(+)-Sj14-3-3,Ni2+亲和层析法纯化获得rSj14-3-3,SDS-PAGE检测其分子量与理论值一致;Westernblotting显示rSj14-3-3能被其特异性单克隆抗体识别。以rSj14-3-3作为诊断抗原分子,经过条件优化建立了rSj-ELISA诊断日本血吸虫病的方法。用rSj-ELISA,SEA-ELISA,SEA-IHA和COPT四种方法平（文章此处忽略..）行检测急、慢性血吸虫病患者,华支睾吸虫患者,肠道线虫患者以及正常人血清,结果示rSj14-3-3用于日本血吸虫病免疫诊断与SEA-ELISA以及SEA-IHA具有相似的敏感性和特异性;rSj-ELISA的敏感性显著优于COPT,但特异性(假阳性以及与其他寄生虫病的交叉反应性)逊于COPT。结论:本研究成功表达并纯化了rSj14-3-3抗原,以此抗原单独包被建立rSj-ELISA方法诊断日本血吸虫病。重组抗原制备简便,成本低廉,制备周期短,方法易于标准化,更适合商品化生产和流行区血吸虫病的血清学辅助诊断。目的:构建日本血吸虫虫卵cDNA文库并用日本血吸虫急性感染患者血清对其进行免疫学筛选,以寻找有效的早期诊断分子和疫苗候选分子。方法:收集日本血吸虫感染6周虫卵,提取总RNA,逆转录生成c（略..）DNA,PCR合成cDNA双链。经过纯化、sfiI酶切、过柱除去小片段后,与λTriplEx2噬菌体载体两臂连接,体外包装后形成日本血吸虫虫卵cDNA文库。用大肠杆菌预吸收的急性血吸虫病患者血清对文库进行免疫学筛选,对复筛得到的14个阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列测定,结果呈送GenBank进行同源性分析,根据其理论氨基酸组成,初步确定该cDNA插入片段所编码蛋白的特性并利用生物信息学软件分析和预测其结构和用途。结果:所构建的日本血吸虫虫卵cDNA初始文库的容量为2.7x106个重组子,经感染XL1-Blue菌后扩增文库的滴度达1010pfu/ml。任意挑取克隆经自身环化后提取质粒,酶切后片段大小范围为400-1500bp,重组率85%以上。用急性日本血吸虫患者血清初筛得到28个阳性克隆,复筛得到14个持续阳性的克（本文此处忽略..）隆,测序后送GenBank进行BLAST比对,其中9号为空载序列,2号无同源基因匹配为可能的新基因,其余序列均为匹配的日本血吸虫相关基因。经生物信息学分析示2号克隆基因具有一个432bp的完整开放阅读框架,Antheprot软件和多种基于网页的在线软件分析其结构和功能并预测可能为一跨膜蛋白。结论:本试验成功地构建了日本血吸虫虫卵cDNA文库,筛选所得到的阳性克隆有望成为早期诊断抗原或保护性疫苗分子,值得进一步研究。

以上为本篇毕业论文范文日本血吸虫信号蛋白14-3-3的免疫诊断及虫卵cDNA文库的构建的介绍部分。

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