用于诊断孢子丝菌病的特异性探针和引物的筛选及孢子丝菌基因分型的比较

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用于诊断孢子丝菌病的特异性探针和引物的筛选及孢子丝菌基因分型的比较

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毕业论文范文题目：用于诊断孢子丝菌病的特异性探针和引物的筛选及孢子丝菌基因分型的比较，论文范文关键词：用于诊断孢子丝菌病的特异性探针和引物的筛选及孢子丝菌基因分型的比较
用于诊断孢子丝菌病的特异性探针和引物的筛选及孢子丝菌基因分型的比较毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：申克氏孢子丝菌是孢子丝菌病的致病菌,主要引起皮肤、皮下组织和附近淋巴系统的亚急性和慢性感染,偶可播散至骨骼和内脏,甚至发生全身的播散性感染。孢子丝菌病在世界范围内广泛分布。目前该病的诊断较为困难。已见文献报道的孢子丝菌相对特异性引物和探针为孢子丝菌病的分子生物学诊断奠定了基础,但尚无资料对各种引物和探针进行过系统地比较。真菌传统的分型方法主要依赖菌体培养和镜下的形态学观察,而申克氏孢子丝菌具有“表型特征基本一致”的特点,因此,利用分子生物学方法对其进行基因分型就显示出一定的优势。曾用于申克氏孢子丝菌种内分型的分子生物学方法有随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、mtDNA的限制性内切酶多态性分析(RFLP)及核糖体基因限制性内切酶多态性分析(rDNAR（本文此处忽略..）FLP)与Southernblotting杂交相结合等方法。本研究旨在以相同的孢子丝菌菌株为样本,对以上3种方法进行比较,以确定在基因分型上哪种方法相关性更好、分辨力更强,并筛选出对孢子丝菌更敏感和更特异的探针和引物,为从基因水平上快速、准确诊断孢子丝菌病奠定基础。材料与方法:1.以50株纯培养的孢子丝菌及标准株为样本,以毛霉、烟曲霉、白色念珠菌各1株为阴性对照,通过对基因组DNA进行PCR扩增,对已见报道的4对孢子丝菌特异性引物进行筛选,引物分别为针对18SrRNA的SS3-SS4、几丁质合成酶基因Ⅰ的S2-R2、拓扑异构酶基因Ⅱ的SSHF31-SSHR97及ITSⅡ区的ITS3-SSP。结果以PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳上出现与标准株同一水平的亮光带型为阳性,对照菌株不出现阳（此处忽略..）性条带的引物即为特异性引物。进一步对阳性的模板倍比稀释,再以特异的引物进行PCR扩增,以DNA模板浓度最低且带型阳性者为更特异、更敏感的引物。2.菌株样本同上,用PCR-ELISA的方法对已见报道的5个孢子丝菌特异性探针进行筛选,探针分别为针对28SrRNA的U26852、U26866、U26866’,针对18SrRNA的M85053及针对ITSII区的AF117945。底物显色者为阳性,依据显色强弱及光密度值大小进行定性定量分析,从而判断探针的敏感性和特异性。3.在本教研室先前进行的“rDNARFLP-Southernblotting杂交”分型的基础上,选择与其相同的32株孢子丝菌为样本,将菌株的mtDNA以限制性内切酶HaeIII酶切进行RFLP分型,同时以随机引物OPAA11对菌株的基因组DNAPCR扩增进行（文章此处忽略..）RAPD分型,对电泳带型进行分析,进一步对三种分型方法进行比较。结果:1.在同样PCR条件下,引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有较好的特异性,引物S2-R2的敏感性更高;4对引物对50株孢子丝菌均能扩增出阳性条带;引物SS3-SS4对白念扩增条带亦为阳性,特异性不强;同一模板浓度下引物SSHF31-SSHR97的敏感性不强。2.在相同的杂交和ELISA条件下,50株孢子丝菌均对探针U26852显色较强,对其它4个探针则显色较弱。3.mtDNA-RFLP方法将32株受试菌株分为5型,分别对应日本学者Ishizaki、林俊萍等在研究世界各地孢子丝菌mtDNA-RFLP基因分型中所命名的1,4,6,7,20五种基因型;RAPD方法则将受试菌株分为7种基因型,且所有菌株均具有约0.6kbp大小的共有条（本文此处忽略..）带;两种方法在孢子丝菌的基因分型与南北方分布及临床分型的联系方面均未表现出明显相关性。结论:1.针对几丁质合成酶基因Ⅰ的引物S2-R2在目前已见文献报道的孢子丝菌特异性引物中最特异、最敏感。2.针对28SrRNA的探针U26852为目前已见文献报道的孢子丝菌特异性探针中最特异和敏感的探针。3.三种孢子丝菌基因分型方法中,rDNARFLP-Southernblotting杂交方法分辨力较高,所分基因型与临床表现及地域分布相关性更好。

以上为本篇毕业论文范文用于诊断孢子丝菌病的特异性探针和引物的筛选及孢子丝菌基因分型的比较的介绍部分。

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