耻垢分枝杆菌MSMEG_1401基因的克隆、表白及其对细胞壁多糖代谢的

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耻垢分枝杆菌MSMEG_1401基因的克隆、表白及其对细胞壁多糖代谢的

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毕业论文范文题目：耻垢分枝杆菌MSMEG_1401基因的克隆、表白及其对细胞壁多糖代谢的，论文范文关键词：耻垢分枝杆菌MSMEG_1401基因的克隆、表白及其对细胞壁多糖代谢的
耻垢分枝杆菌MSMEG_1401基因的克隆、表白及其对细胞壁多糖代谢的毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是一种古老的且重大迫害人类健康的疾病,也是寰球关注的公共卫生问题跟社会问题。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是引起结核病的病原体。因为耐多药菌株的呈现跟HIV(HumanImmunodeficiencyVirus)的协同作用,使得一度被把持的结核病的发病率在寰球范畴内明显回升,因此,寻找新一代抗结核药物己火烧眉毛。结核分枝杆菌细胞壁是细菌特有的、赖以生存的构造基本。其核心构造由最内层的肽聚糖(Peptidoglycan,PG)、旁边层的聚阿拉伯糖半乳糖(Aribinangalactan,AG)以及最外层的分枝菌酸(Mycolicacid)所构成。聚阿拉伯糖半乳糖为连接肽聚糖跟分枝菌酸、保持细胞壁构造完全性的重要组分,所以可作为研发新一代抗结核药物的幻想靶标。而通过阐明现有药物的作用机制可能发明相干代谢中的关键蛋白并将其断定为潜在的药物靶点。抗结核的一线药物之一乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)是抑菌剂,对细胞外繁殖期的结核分枝杆菌的成长有克制造用,且不表示出明显的耐药性。美国科罗拉多州破大学微生物系MikeMcNeil教养的一项实验成果显示,在结核分枝杆菌的培养基中参加乙胺丁醇后,细胞壁中的聚阿拉伯糖在短时光内大量消散,使得细菌名义的阿拉伯糖跟（此处忽略..）半乳糖的含量比例产生明显改变,为了寻找EMB的作用机制以及与细胞壁名义多糖代谢变更的关联,前期本研究室的湛垚垚博士用双向电泳跟质谱的方法找出了EMB作用于耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis,M.smegmatis)(因存在与M.tuberculosis类似的细胞壁构造且成长敏捷,无病原性,而被用作M.tuberculosis的模式菌)前后的蛋白表白差别点。本论文的实验目标:根据本研究室湛垚垚博士的双向电泳跟质谱成果,在NCBI基因数据库中寻找相干蛋白的基因序列,设计引物,采取RT-PCR(reversetranscriptasepolymerasechaieaction,逆转录聚合酶链反应)的方法来检测EMB作用前后蛋白表白差别点所对应的基因的表白变更情况。如表白程度增高十明显显,则咱们对相应基因在耻垢分枝杆菌中进行克隆表白,人为地进步相干基因的表白程度,终极用HPLC(highperformanceliquidchromatography,高效液相色谱)的方法检测细胞壁阿拉伯糖(Arabinose,Ara)跟半乳糖(Galactose,Gal)的含量比例变更,如阿拉伯糖的比例降落,则阐明所研究的基因与细胞壁多糖的代谢密切相干,为后续更深一步的探讨研究提供实验基本。本论文的实验内容及成果:1.筛选（文章此处忽略..）目标基因根据湛垚垚的质谱成果,对EMB作用前后表白变更差别性明显的蛋白在NCBI蛋白跟基因数据库中寻其绝对应的基因序列,设计引物,进行RT-PCR,终极抉择了12个基因进行逆转录PCR实验,其中accA(MSMEG_0334,乙酰辅酶A羧化酶a亚基)、tpx(MSMEG_3479,巯基过氧化物酶)、tuf(MSMEG_1401,细菌翻译延长因子Tu)、bfr(MSMEG_3564,细菌铁蛋白)四种基因表白上调;groEL(MSMEG_0880,伴侣蛋白)、cys(MSMEG_4190,肌醇单磷酸酶家族蛋白)、mtrA(MSMEG_1874,DNA结合反应调节蛋白)、hisA(MSMEG_3209,组氨酸合成异构酶)、fdxA(MSMEG_1125,转录调节蛋白)、gpd(MSMEG_0777,依附F420的六磷酸葡萄糖脱氢酶)、gk(MSMEG_6759,甘油激酶)、pst(MSMEG_5782,磷脂酸盐特异性转运体系蛋白)八种基因表白下调。根据Labworks凝胶成像分析体系分析的成果,咱们抉择表白上调最为明显的tuf基因作为目标基因进行克隆跟表白。2.利用PCR方法扩增出正确的目标MSMEG_1401基因从NCBI基因数据库中获得mc2155菌株的MSMEG_1401基因核苷酸序列(1191bp)。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物,并在上游引物跟下游引物的5’端分辨引入了NdeI跟HindIII限度性内切酶位点。以便将MSMEG_1401基因连接到pVV2表白载体的NdeI跟HindIII（此处忽略..）位点。器具高保真性的LATaqDNA聚合酶,以mc2155菌株基因组DNA为模板成功扩增了MSMEG_1401基因。3.克隆MSMEG_1401基因及核苷酸序列测定将上述PCR产物连接到克隆载体pMD18-T的EcoRV位点,将连接产物转化到大肠杆菌NovaBlue菌株的感触态细胞中。经过蓝百斑筛选而后再用限度性内切酶酶切方法筛选出阳性重组质粒pMD18-MSMEG1401。对MSMEG_1401基因进行DNA序列测定,测序成果与耻垢分枝杆菌mc2155菌株基因组数据库中的MSMEG_1401基因序列完全一致,表明用PCR技巧扩增的MSMEG_1401基因不存在任何碱基渐变。4.表白载体pVV2-MSMEG1401的构建用NdeI跟HindIII双酶切pMD18-MSMEG1401阳性重组质粒,回收与纯化MSMEG_1401基因后,将MSMEG_1401基因连接到表白载体pVV2的NdeI跟HindIII位点,并用连接产物转化NovaBlue感触态细胞,用BamHI跟KpnI双酶切方法鉴定重组表白载体pVV2-MSMEG1401。表白载体中的MSMEG_1401基因产物的N端与pVV2表白载体上的6个持续组氨酸标记构成融合蛋白,便于目标蛋白的检测。5.MSMEG_1401目标蛋白在耻垢分枝杆菌中的表白将表白质粒pVV2-MSMEG1401电转化到耻垢分枝杆菌mc2155菌株中,在37°C前提下表白目标蛋白。用SDS-PAGE电泳跟Westernblotting方（本文此处忽略..）法检测跟鉴定目标蛋白的表白情况。6.用高效液相色谱法检测细胞壁阿拉伯糖跟半乳糖的含量比例变更提取野生型跟高表白MSMEG_1401蛋白的M.smegmatismc2155菌株的细胞壁多糖,制备阿拉伯糖跟半乳糖的单糖,在必定色谱前提下,根据提取样品相应各组分的出峰面积大小来比较野生型跟高表白MSMEG_1401蛋白的M.smegmatismc2155菌株的细胞壁阿拉伯糖跟半乳糖的含量比例变更。论断:本课题利用分子克隆技巧克隆了耻垢分枝杆菌的MSMEG_1401基因,并在耻垢分枝杆菌mc2155中高表白出MSMEG_1401目标蛋白。终极用HPLC的方法测验了MSMEG_1401蛋白是否与细胞壁多糖的代谢密切相干,为后期更进一步探讨该蛋白与聚阿拉伯糖的关联价值奠定了前提基本。

以上为本篇毕业论文范文耻垢分枝杆菌MSMEG_1401基因的克隆、表白及其对细胞壁多糖代谢的的介绍部分。

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