含有ADV耐药突变的HBV聚合酶RT区的原核表达及耐药检测研究

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含有ADV耐药突变的HBV聚合酶RT区的原核表达及耐药检测研究

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毕业论文范文题目：含有ADV耐药突变的HBV聚合酶RT区的原核表达及耐药检测研究，论文范文关键词：含有ADV耐药突变的HBV聚合酶RT区的原核表达及耐药检测研究
含有ADV耐药突变的HBV聚合酶RT区的原核表达及耐药检测研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：背景乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，其感染仍是世界范围内慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要成因，严重危害人类健康[1]，而治疗慢性乙型肝炎的首要目标是持久抑制病毒的复制。阿德福韦酯（Adefovir，ADV）是目前被批准治疗慢性乙型肝炎的一种核苷类似物药物，通过抑制HBV聚合酶（HBVPolymerase，HBV-Pol）的活性来抑制病毒复制，但是长期治疗会发生耐药导致治疗失败[2]。HBV聚合酶主要分成四个结构域：N末端蛋白区（TP），间隔区（SD）（本文此处忽略..），逆转录酶区（ReverseTranscriptase，RT），核糖核酸酶（RNaseH）区~[3]。该蛋白同时具有DNA聚合酶和RNaseH酶活性，直接参与了HBV基因组的复制。HBV繁殖速度快，但其DNA聚合酶缺乏纠错能力，复制过程中有大量突变发生，使得药物与HBV聚合酶的亲和力下降，进而导致药物抑制病毒复制的作用明显减弱[4,5]，其中HBV聚合酶RT区域的rtN236T和rtAl81T/V变异是与阿德福韦耐药有关的常见变异位点[6,7]。临床研究发现，一些患者在长期使用同一种抗病毒药物治疗过程中会（此处忽略..）发生病毒载量的―反跳‖，先前的药物已经不能抑制病毒的复制。可见先前用药造成的突变能改变后续的治疗方案和治疗效果。因此开展对HBV聚合酶RT区域功能的研究和对ADV等核苷类似物引起的耐药进行实时监测尤为必要。目的本课题一方面拟通过表达纯化HBV聚合酶RT区蛋白，来探索ADV抑制RT的机制；另一方面尝试建立一种快速、灵敏、特异检测ADV耐药突变株的方法，实现实时监测ADV耐药突变的发生，为后续治疗方案的调整提供依据。方法1:以临床慢性乙肝患者血清中的HBVDNA为模板，克隆HBV聚合酶RT区（此处忽略..）到原核表达载体pHis-SUMO载体上，构建了重组表达质粒SUMO－RTWT，进一步通过定点突变构建含有阿德福韦耐药突变位点(181T/V+236T)的原核表达质粒SUMO－MT1和SUMO－MT2，原核表达产物经SDS-PAGE及Westernblot鉴定，并进行原核表达条件的优化和HBV聚合酶RT区域的结构建模。2:利用反向杂交技术原理设计特异性肽核酸探针，通过氨基酸偶联在尼龙膜基质上，通过一系列优化实验，包括探针浓度，杂交条件，洗脱条件等进行优化，筛选出最佳反应条件，能特异性检测常见的ADV耐药突变位（本文此处忽略..）点；利用构建的含有ADV耐药位点的标准质粒株完成方法学评价，同时通过临床样本对检测指标（灵敏度、准确性和精确度）的评价。结果通过分子克隆的技术，成功克隆、表达三种融合蛋白、纯化得到其中一种蛋白，westernblot验证蛋白的表达伴随有分子伴侣GroEL的表达。由于蛋白量少且极不稳定无法完成蛋白质结晶。采用标准质粒株检测建立了肽核酸反向杂交的方案，优化了杂交条件并且完成了对含有ADV耐药位点检测的方法学评价，对临床样本的检测为后续试验。

以上为本篇毕业论文范文含有ADV耐药突变的HBV聚合酶RT区的原核表达及耐药检测研究的介绍部分。

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