人类心肌α-actin启动子真核表达载体的构建及在ES细胞中的初步应

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人类心肌α-actin启动子真核表达载体的构建及在ES细胞中的初步应

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人类心肌α-actin启动子真核表达载体的构建及在ES细胞中的初步应毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：心肌坏死导致心肌细胞死亡，进一步导致心衰、心肌重构等。由于成年化的心肌细胞不能分裂，寻找可替代死亡心肌细胞的移植物来治疗心肌坏死是近年来研究的热点。胚胎干细胞具有多分化潜能，适宜条件下可分化为多种细胞，从而构成机体的不同器官与组织。利用ES细胞的分化潜能和定向分化的可调性，将胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞，可以作为心肌细胞移植治疗的细胞来源。但是，对这种来源的心肌细胞要求很高纯度，因为全能干细胞移植到个体可能会导致畸胎瘤。研（文章此处忽略..）究表明，通过基因操作可以从分化的ES细胞中纯化获得所需的心肌细胞。α-actin是心脏发生的最早标志，在ES细胞分化为自发收缩的心肌细胞之前特异性表达，指导其组织特异性表达的是α-actin基因启动子。对这一启动子的研究，不仅可间接研究心肌发育过程，更重要的是可以用来做调控序列纯化ES细胞源心肌细胞作移植治疗。本实验的目的旨在构建出含人类心肌α-actin启动子的真核表达载体，用来转染小鼠ES细胞，纯化和进一步研究ES细胞（略..）源心肌细胞。我们用PCR法直接从全基因组中扩增人类心肌α-actin基因的启动子片段，连接到pMD-18T载体上，酶切鉴定并测序。进而将这一调控区与去掉巨细胞病毒启动子的真核表达载体pEGFP-N1（４.1kb）进行重组，获得了真核表达载体，命名为α-actin-pEGFP-N1。将α-actin-pEGFP-N1纯化后，通过脂质体包裹转染小鼠ES细胞，进行免疫组化染色。本研究分为两部分：１、根据已发表的人类心肌α-actin启动子基（本文此处忽略..）因的序列设计1对含有特异性酶切位点的引物，并利用PCR技术进行扩增。序列分析表明，扩增片段虽然与Genbank里登陆的序列同源性仅为72%，但包含有完整的启动子元件和转录专一调节因子相应的识别序列，尤其是(AP1、SP1、TATA盒、CAAT盒、转录起始点等)。２、尝试用pEGFP-N1作为框架结构，获得了含人类心肌α-actin启动子的真核表达载体α-actin-pEGFP-N1；用纯化的EGFP质粒，在不同的条件下转染小鼠ES细胞，摸索与（本文此处忽略..）优化实验条件。结果表明：（1）DNA浓度为3.0~5.0μg/ml，转染时间为2~3h效果最优；（２）药物筛选时，以一周杀死全部非阳性细胞的G418浓度(200μg/ml)为宜；（３）转染48h后在荧光显微镜下观察发现绿色荧光蛋白在ES细胞中有较强的表达，传代（传2代）细胞免疫组化结果为阳性，表明本研究采用的约450bp的启动子序列，虽然较短但获得了表达，说明该序列有相当强的调控能力。

以上为本篇毕业论文范文人类心肌α-actin启动子真核表达载体的构建及在ES细胞中的初步应的介绍部分。

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