慢病毒载体法制备双报告基因Fluc-mRFP转基因小鼠

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慢病毒载体法制备双报告基因Fluc-mRFP转基因小鼠

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毕业论文范文题目：慢病毒载体法制备双报告基因Fluc-mRFP转基因小鼠，论文范文关键词：慢病毒载体法制备双报告基因Fluc-mRFP转基因小鼠
慢病毒载体法制备双报告基因Fluc-mRFP转基因小鼠毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：遗传工程小鼠的功用小鼠因其一些独特特点和优势已成为研究基因功能、开展发育生物学研究、建造人类疾病动物模型及研究人类疾病发病机制等的最重要的和最佳的模式实验动物。识别基因功能最有效方法是观察基因功能缺失或基因过表达后,细胞和机体所产生的表型变化。利用转基因(Transgene)和基因打靶(Genetargeting)[包括基因敲除(Geneknockout)和基因敲入(Geneknockin)等]等技术产生的遗传工程小鼠(Geneticallymodifiedmice,GMMs)是最具研究价值的工具之一。GMMs已成为在整体动物水平研究人体发育、解析基因功能或疾病相关基因功能,研究人类疾病发病机制,解答特定人群对某种疾病的易感性,识别药靶,新药筛选和疗效判定等最为有效的手段。慢病毒载体法制备转基因小鼠的优势原核显微注射法为目前最经典的和最成熟制备转基因小鼠的方法,被广泛采用,但是显微注射制备转基因动物的效率很低。近年来,随着不同用途慢病毒载体的问世,慢病毒介导的转基因动物制作方法逐渐受到人们青睐;迄今,利用慢病毒载体法已成功制备了转基因小鼠、大鼠、猪、牛和鸡等,效率较以往的方法高许多,该方法已被证明是普遍适用于从哺乳类动物到禽类的转基因动物制作方法。与原核显微注射法相比,慢病毒载体法有如下优势:(1)原核显微注射时注射针必须插入核膜清晰的核内,因不同品系小鼠原核大小和核膜清晰度差异显著,致转基因效率受到所选小鼠品系的影响,而慢病毒卵周隙注射时,注射针无需插入核内,因而不受这一限制,并且操作较原核显微注射法简单的多;(2)慢病毒卵周隙注射时对细胞膜和核膜均无损伤,因而胚胎存活率高;(3)慢病毒载体法的转基因效率远远高于传统的原核显微注射法。掌握慢病毒载体法制备转基因小鼠技术的现时重要性和必要性利用遗传工程小鼠在体内解析基因功能的策略可分为:基因功能缺失(Lossofgenefunction)和基因功能获得(Gainofgenefunction)。在体内实现基因功能缺失的主要策略主要包括:(条件性)基因敲除、(条件性)转基因RNA干涉(RNAi)和负显性突变体(Dominantn（本文此处忽略..）egativemutant)技术等,而在体内实现基因功能获得的主要策略:目的基因(条件性)过表达等。近若干年来,针对不同基因采用不同的基因功能研究策略,利用不同类型的慢病毒载体借助慢病毒载体法建立了相应的转基因小鼠,在转基因小鼠体内已实现或有望实现如下目标:(1)基因功能获得[目的基因(条件性)过表达]和(2)基因功能缺失[(条件性)转基因RNAi和负显性突变体技术],以上策略和方法许多已成功用于在小鼠体内解析基因功能,这些都说明基于慢病毒载体法制备的转基因小鼠为活体内研究基因功能提供了理想的三维研究体系。灵敏的非损伤、实时和可视化体内示踪移植供体细胞及其在体内衍生的细胞目前,除胚胎干细胞外,小鼠不同组织来源的成体干细胞均未建立成熟的体外培养体系,这给外源基因(包括报告基因)导入带来诸多不便;为此,在进行移植实验时,往往从报告基因转基因小鼠(报告基因的表达受普遍性的/无细胞或无组织特异的启动子调控)相应组织(如骨髓等)中获取报告基因标记的待移植细胞。活体内生物发光[用荧光素酶(Luciferase,Luc)基因标记细胞等)成像和荧光[荧光报告基团(GFP和RFP等)]成像各有其优点,如生物发光成像灵敏度高、特异性极强、可精确定量和组织穿透能力强等,而荧光成像虽有背景噪音、灵敏度低和穿透能力弱等缺点,但荧光信号强、标记靶点多样、观察直观和检测方便等。因此,对于不同研究,应根据生物发光成像和荧光成像各自特点和优势进行选择。为将生物发光和荧光的优点集为一身,有研究者通过GFP转基因小鼠和Luc转基因小鼠交配以获得双报告基因(GFP和Luc)转基因小鼠,并进而从其骨髓中分离得到双报告基因标记的移植供体细胞——造血干细胞(HSCs),以供移植实验来研究造血重构,从而实现非损伤、实时和可视化体内监测造血重构过程。目前,报告基因(GFP、mRFP或Luc)表达受无细胞或无组织特异启动子驱动的转基因小鼠均是单报告基因的,而通过以上方法获得双报告基因标记的供体移植细胞需花费较长时间。有鉴于此,本课题拟借助慢病毒载体法制备双报告基因Fluc-mRFP(即萤火虫荧光素酶和单体红色荧光蛋白)转基因小鼠（本文此处忽略..）,以实现下列目标:(1)熟练掌握基于慢病毒载体法制备转基因小鼠的技术;(2)建立双报告基因Fluc-mRFP转基因小鼠,以为后续研究(如干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等)提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,以借助此类三报告基因标记的供体细胞将生物发光(Bioluminescence)和荧光(Fluorescence)两项技术融为一身,从而为实现灵敏的非损伤、实时和可视化体内示踪移植供体细胞及其在体内衍生的细胞奠定基础。目的:基于慢病毒介导的转基因方法制备Fluc-mRFP(FR)转基因小鼠,即通过建立FR转基因小鼠得以掌握慢病毒载体法制备转基因小鼠的技术,从而实现多种目的(见上)。方法:1)慢病毒载体phUb-FR鉴定酶切鉴定分别使用NotⅠ、MluⅠ和BamHⅠ对phUb-FR进行单酶切,酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。PCR鉴定根据FR序列设计引物分别扩增Flue、mRFP和ttk基因;PCR扩增后,取5μl反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳。2)慢病毒生产与鉴定慢病毒包装与浓缩按标准程序进行慢病毒包装(脂质体介导的瞬时转染)、超速离心浓缩和保存等。慢病毒成功生产的鉴定用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞,24～48h后荧光显微镜下观察是否见红色荧光。3)利用细胞模型在体外验证Flue和mRFP能否正常表达从正常293FT细胞和病毒感染后的293FT细胞提取总RNA,并进而采用RT-PCR检测Fluc和mRFP能否正常表达。4)慢病毒载体法制备FR转基因小鼠特殊用途小鼠准备按标准程序准备受精卵供体母鼠、种公鼠、结扎公鼠和假孕母鼠等;慢病毒卵周隙注射制备FR转基因小鼠将浓缩后的病毒注射入小鼠受精卵的卵周隙中,然后将注射后状态良好的受精卵移植进ICR假孕母鼠输卵管内,并将假孕母鼠送回笼内并观察直至恢复知觉,仔鼠一般19.5～20.0d后出生。5)FR转基因首建鼠的筛选与鉴定获得子代小鼠后,首先应用体视荧光显微镜、小动物活体成像仪和流式细胞仪等检测各组织中mRFP和Fluc表达,并应用PCR技术鉴定转基因FR是否成功整合进小鼠基因组,来进一步验证上述结果,以获得FR转基因小鼠,即获得FR转基因首建鼠（略..）。(1)体视荧光显微镜和小动物活体成像仪检测mRFP和Flue表达以筛选和鉴定FR转基因鼠:体视荧光显微镜初筛FR转基因鼠将出生几天后的乳鼠置于体视荧光显微镜下,检测mRFP表达以初步鉴定FR转基因鼠,并从中初筛出荧光强度适中的乳鼠。体视荧光显微镜检测转基因鼠各器官mRFP表达在小鼠出生3周后,小鼠灌注后取出各脏器,并荧光镜检,方法如下:小鼠深度麻醉后,用PBS自小鼠左心室注入至右心房流出,直至流出液变成无色透明后,收集主要脏器(如心脏、肺、脑、肾脏、肝脏、脾脏、胸腺、肌肉、皮肤、小肠等)。并在荧光体视显微镜下检测红色荧光。小动物活体成像仪检测Flue表达检测前,小鼠腹腔注射D-luciferin(0.15mg/gbodywt),同时麻醉小鼠;注射底物5-10min后,利用小动物活体成像仪检测Fluc表达。(2)PCR检测小鼠基因组中Flu-mRFP整合以从潜在的FR转基因小鼠和野生型小鼠(阴性对照)鼠尾组织提取的基因组DNA及质粒phUb-FR为模板,分别PCR扩增Flu、mRFP和ttk基因片段,以鉴定潜在的FR转基因小鼠的基因型。6)FR转基因首建鼠繁殖传代及转基因遗传和表达稳定性检测将mRFP表达阳性及PCR阳性的首建鼠与野生型ICR鼠交配以传代,获得F_1后,用体视荧光显微镜,检测mRFP是否在F_1代表达,对其表达稳定性做出判断,并进而间接判断转基因是否稳定遗传。结果:1)慢病毒载体phUb-FR鉴定酶切鉴定phUb-FR经NotⅠ、MluⅠ和BamHⅠ分别单酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳均可见两条预期大小的条带。PCR鉴定以质粒phUb-FR为模板,分别扩增Fluc、mRFP、ttk,三PCR产物大小均与预期值相符。2)慢病毒包装、浓缩及鉴定携带FR基因慢病毒的生产与鉴定将phUb-FR与病毒包装质粒共转染293FT细胞,48h后倒置荧光显微镜下可见红色荧光,预示转染成功。用收集的病毒上清感染293FT细胞,48h后倒置荧光显微镜下可观察到红色荧光,这进一步说明病毒已成功生产;同时也表明转基因mRFP能够正常表达。3)利用细胞模型在体外验证Flue和mRFP能否正常表达用携带F（文章此处忽略..）R慢病毒感染293FT细胞,48h后在倒置荧光显微镜下见红色荧光,这表明转基因mRFP能够正常表达;同时,利用RT-PCR在mRNA水平亦证实转基因Fluc和mRFP能够正常表达。4)FR转基因小鼠的建立慢病毒注射入580枚单细胞受精卵的卵周隙,存活胚胎556枚,将525枚卵周隙注射有慢病毒的胚胎移植给28只假孕母鼠,22只怀孕,共获仔鼠136只,DNA水平检测证实其中63只基因组中整合有外源基因Flu、mRFP和ttk,即获得63只PCR阳性的FR转基因首建鼠,首建鼠FR整合率达46%。在蛋白水平,利用体视荧光显微镜和/或小动物活体成像系统检测mRFP表达,证实63只PCR阳性的转基因小鼠中,47只正常表达mRFP,其中16只强表达mRFP,31只弱表达mRFP。同时,利用小动物活体成像仪亦可在mRFP阳性的FR转基因小鼠检测到Fluc表达。5)FR首建鼠繁殖传代及外源基因遗传和表达稳定性检测体视荧光显微镜检测显示,F_1代鼠中部分个体表达mRFP,这预示外源基因不仅可以从一代向下一代稳定传递,且能够稳定表达。6)FR转基因鼠主要脏器mRFP表达的检测在体视荧光显微镜下,F1代的FR转基因小鼠的脑、脾脏、肾脏和小肠等可见红色荧光。结论:1)运用慢病毒载体法成功建立FR转基因小鼠,获得63只PCR阳性首建鼠,首建鼠FR整合率达46%;2)63只PCR阳性首建鼠中,47只正常表达mRFP,其中16只强表达mRFP;同时也可在PCR阳性首建鼠上检测到Fluc表达;3)FR转基因首建鼠携带的外源基因不仅可以向下一代传递,且FR转基因能够稳定表达;4)FR转基因鼠的主要脏器(如脑、脾脏、肾脏和小肠等)可见红色荧光。

以上为本篇毕业论文范文慢病毒载体法制备双报告基因Fluc-mRFP转基因小鼠的介绍部分。

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