蚓激酶山羊乳腺生物反应器研究及其表达

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蚓激酶山羊乳腺生物反应器研究及其表达

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毕业论文范文题目：蚓激酶山羊乳腺生物反应器研究及其表达，论文范文关键词：蚓激酶山羊乳腺生物反应器研究及其表达
蚓激酶山羊乳腺生物反应器研究及其表达毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：本课题为国家“863”生物反应器重大专项(2002AA206653)—蚓激酶山羊乳腺生物反应器研究，最终目的为通过基因工程手段建立蚓激酶转基因山羊乳腺生物反应器，实现由羊乳中表达蚓激酶，直接饮用羊乳就可以达到治疗血栓和保健的目的。目前已完成了蚓激酶在山羊乳腺中的暂时表达并已检测出其纤溶活性，蚓激酶在哺乳动物细胞中的表达研究和将蚓激酶逆转录病毒载体转染山羊乳腺并整合表达这部分工作。血栓性疾病的发病率和死亡率均较高，并呈现逐年上升趋势。迄今为止，人们从多种生物组织、体液中提取到了各种溶栓酶，如尿激酶、链激酶和蝮蛇抗栓酶等，并已经开发成抗血栓类药物。但由于这些药物的原料非常的缺乏，如每升人尿中含有尿激酶一万分之五克，从而导致药价非常昂贵，而且这些药物在临床应用上存在各种各样的问题，如容易失活、体内停留时间短暂及导致出血等缺陷。大量的研究及药效学实验证明，蚯蚓的蛋白提取物蚓激酶具有明显的防止血液凝集、抑制血栓形成及溶血栓作用。口服剂型的粗提蚓激酶制剂已在临床上得到应用，疗效可靠，如百奥蚓激酶胶囊、博洛克等。应用基因工程手段表达蚓激（本文此处忽略..）酶目前还处于初级阶段。孙兆军等将蚓激酶基因PI_(239)基因克隆至真核表达载体pcDNA3，转染BHK细胞，转染后的细胞通过PCR可扩出与目的基因大小相同的片段，但纤维蛋白溶圈试验及SDS-PAGE电泳均未检测到蚓激酶蛋白。之后，又构建成熟肽与绿色荧光蛋白融合的表达质粒转染BHK细胞，结果显示PI_(239)成熟肽在BHK细胞中表达。沈悦等利用基因重组技术将蚓激酶基因PI_(239)基因通过细菌／杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统构建重组杆状病毒表达载体，将重组病毒转染昆虫Sf9细胞，通过SDS-PAGE电泳可以见到相对分子量3.0万位置有蛋白表达，免疫印记试验结果证明该条带可以与PI_(239)抗体反应。(1)蚓激酶乳腺组织特异性表达载体的构建及其在山羊乳腺中的暂时表达。以合成的蚓激酶cDNA突变体为目的基因，以pGEM-T-bCP、pIRESlneo和pMD18-T-LK为原始质粒，经系列酶切、连接和转化后得到以山羊β-酪蛋白启动子为上游调控序列的乳腺组织特异性表达载体pIbCP-LK-neo和含有两个目的基因拷贝的表达载体pIbCP-LK-（略..）LK。以山羊乳腺作为生物反应器，在稳定泌乳期于乳腺组织分别注射以上两种表达质粒，采集乳汁，通过纤维蛋白平板溶圈试验进行纤溶活性测定。结果显示，注射了蚓激酶表达质粒的山羊奶具有明显的纤溶活性；pIbCP-LK-LK蚓激酶在奶中的表达量高于pIbCP-LK-neo。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析表明，表达的蚓激酶分子量为26kDa。本试验系首次实现了蚓激酶在山羊乳腺中的基因工程暂时表达，为通过转基因途径生产蚓激酶奠定了基础。(2)蚓激酶基因在Vero细胞及DK细胞中的表达。以巨细胞病毒CMV启动子作为上游调控元件，由质粒pMD18-T-LK及真核表达质粒pIRESlneo构建了真核表达质粒吉林农业大学硕士学位论文绷激醉山羊乳腺生物反应器研究及其表达PILK，并将其用脂质体介导法转染vero一dhfr一细胞及DK一dhfr一细胞进行表达。通过G418杭性筛选试验确定vero一dhfr一细胞、DK一dhfr一细胞对G418的耐受浓度分别为600ug/耐和1looug/耐。质拉PILK转染以上两种细胞进行暂时表达未获得洲激酶。（文章此处忽略..）同时在G418杭性筛选条件下转染两种细胞，细胞全部死亡，并未挑选出肉眼可见的克隆。新近研究发现蛆绍!纤溶酶除了对纤维蛋白(原)和纤溶酶(原)有水解作用外，还可水解免疫球蛋白、白蛋白和肌酸激酶等，提示该酶具有广泛的底物。PILK真核表达载体转染vero一dhfr一细胞及DK一dhff细胞后，因为这两种细胞内可能含有划激酶底物，该靶蛋白的分解导致细胞死亡。(3)PA317一pLNbLK细胞株的建立及绍l激醉逆转录病毒转染山羊乳腺。因为逆转录病毒载体结构简单，具有转染效率高，较高的犯细胞特异性的特点，所以试验采用洲激酶逆转录病毒载体pu化LK转染山羊乳腺表达绍1激酶。p址化LK是由以下几部分组成:3’、5’长末端重复序列(LTR)，LTR实际上是一个结构复杂的真核启动子，对病毒基因组的转录起调控作用，宿主细胞的各种反式作用因子也是通过LTR来影响基因的表达。两个LTR各有长度60obP左右的核普酸。LTR包含了各种调控病毒基因表达的元件，如病毒的启动子(prolnoter)、增强子(enhancer)、RNA转录终止信号即polyA，以及整合至宿主（略..）基因组的信号。平为病毒包装信号。Neor为新霉素杭性基因，可对新霉素类似物G418产生杭性。bcP为山羊B一酪蛋白启动子(B一caseinProlnoter)，可用于乳腺定位表达目的蛋白。LK为刘激醉基因。初p为胺千青霉素杭性基因。通过脂质体介导法将重组洲激酶逆转录病毒载体p址化LK转染PA317包装细胞系，在G418杭性筛选条件下建立六株克隆细胞株队317一LKi，队317一LKZ，双317一LK6，队317一从7，PA317一LK10，以317一L地。提取克隆细胞株的基因组，设计PcR引物，以PcR方法检测，扩增出58obP的基因条带，证明逆转录病毒载体p址化LK已整合入PA317细胞基因组中。经PA317细胞包装的病毒释放于细胞培养基中，取病毒上清，以NIH3T3细胞浏定其滴度，其中细胞株PA317一LK

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