人心肌特异表白基因p93、Nelin的原核表白与纯化

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人心肌特异表白基因p93、Nelin的原核表白与纯化

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毕业论文范文题目：人心肌特异表白基因p93、Nelin的原核表白与纯化，论文范文关键词：人心肌特异表白基因p93、Nelin的原核表白与纯化
人心肌特异表白基因p93、Nelin的原核表白与纯化毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标p93跟Nelin是近年来在构建成人心脏cDNA文库并进行新ESTs(expressedsequencetags)分别的基本上，克隆出的心脏特异表白的基因。为研究其功能，进行基因的原核蛋白表白与纯化。采取分子克隆技巧，分辨构建p93与Nelin的全长及缺失体片段的原核表白载体，并进行表白纯化，以获取p93与Nelin的重组蛋白。方法(1)携带p93全长的GST融合表白载体pGEX-5X-p93转化大肠杆菌BL21，IPTG引诱，产物分辨用谷胱甘肽琼脂糖层析柱跟电泳切胶分别纯化。(2)设计带有NcoⅠ／XhoⅠ酶切位点的引物，以已构建好的质粒pGEX-5X-p93为模板，用PCR分辨扩增出p93全长及p93的激酶与丝氨酸构造域的C端1200bp的片段(后者简称为p93-C)，并用NcoⅠ／XhoⅠ酶切PCR产物跟原核表白载体pET28a(+（略..）)，用T4DNA连接酶分辨将其连接，得到重组表白质粒载体pET28a-p93跟pET28a-p93-C。质粒经双酶切鉴定跟测序验证。重组表白质粒pET28a-p93跟pETF28a-p93-C转化大肠杆菌BL21(DE3)，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)引诱，SDS-PAGE进行分析，产物用Ni~(2+)金属螯合吸附层析柱纯化。(3)采取Western杂交的方法用抗GST多克隆抗闭会证GST-p93蛋白，用抗GST-p93多克隆抗闭会证p93-his_6跟p93-C-his_6蛋白。(4)Nelin基因的蛋白质猜测分析。用Kyte-Doolittle打算猜测蛋白质的亲水性，Emini打算猜测蛋白质的名义可及性，Welling打算猜测蛋白质的抗原性，Karplus-Schulz标准分析肽链柔性，经综合分析以猜测Nelin基因的B细胞表位。(5)根据（略..）B细胞表位，结合同源比，以Nelin基因所包含的F-actin结合构造域跟Ig构造域为划分区段标记，设计3个Nelin基因的缺失体片段：Nelin-1,1-133aa;Nelin-2,66-252aa;Nelin-3,227-448aa。其中Nelin-2含有F-actin结合构造域，Nelin-3含有Ig构造域。(6)利用基因重组技巧构建GST融合的原核表白载体pGEX-5X／Nelin1～3，跟C端带有his_6纯化标签的载体pET28a-Nelin-Ⅰ。转化大肠杆菌BL21(DE_3)，IPTG引诱，SDS-PAGE分析，Western杂交验证。成果(1)GST-p93蛋白获得了高效表白，并重要以包涵体情势存在，谷胱甘廷边大毋硕士研究生学位论文肤琼脂糖层析柱纯化后杂蛋白较多，电泳切胶分别纯化得到了纯度在95%以上的GsT-p93蛋白。(2)成功构建了pE（文章此处忽略..）T28a-p93跟pET28a一p93一C原核表白载体。P93一c一his。与p93一his6融合蛋白亦均以包涵体情势存在。用镍离子困iz+)金属鳌合吸附层析柱纯化得到了纯度在95%以上的p93一his6跟p93一C一his6蛋白。经Bradford法测定，100ml菌液引诱后可得到o.smg纯化的p93一his6蛋白或Zmg纯化的p93一C一his6蛋白。(3)Western杂交检测后确认pGEX一SX一p93、pET28a一p93跟pET28a一P93一C的表白产物均为正确产物。(4)Nelin基因氨基酸序列N端的27~39区段、90一102区段、158一170区段可能为B细胞上风表位区域。(5)Nelin一l在pGEX跟pET两套表白体系中均有较高程度表白，nelin一2表白较低，nelin一3表白程度极低。抉择带有his6标签的nehn一!作为纯化对象，经Ni2+金属鳌合层析纯化，得到了nelin（此处忽略..）一1一his6蛋白，纯度在95%以上。论断重组GST-p93与Nelin一卜his6蛋白的成功纯化使P93与Nelin的多抗跟单抗制备得以实现，p93的激酶与丝氨酸构造域的C端片段在大肠杆菌中的表白与纯化，为其复性研究以及进一步的构造跟功能研究提供了前提。

以上为本篇毕业论文范文人心肌特异表白基因p93、Nelin的原核表白与纯化的介绍部分。

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