拟南芥AtGEN1的克隆、原核表达及其生物学功能的研究

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拟南芥AtGEN1的克隆、原核表达及其生物学功能的研究

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毕业论文范文题目：拟南芥AtGEN1的克隆、原核表达及其生物学功能的研究，论文范文关键词：拟南芥AtGEN1的克隆、原核表达及其生物学功能的研究
拟南芥AtGEN1的克隆、原核表达及其生物学功能的研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：自然界所有生物的基因组完整性都会受到不同环境损伤因素和细胞新陈代谢副产物的威胁，进化通过DNA损伤修复和同源重组机制来移除这些不利损伤，从而维持基因组的完整性，保证遗传信息在生物世代之间的稳定传递。解离重组修复过程中形成的Hj（Hollidayjunction）中间体的核酸酶称为“解离酶”。已有研究报道了真核生物酵母和人类解离酶的酶活特征，关于植物界解离酶的研究未见报道。本研究首次通过反转录PCR获得了模式植物拟南芥解离酶的候选基因At1g01880和At3g48900，经过实时定量PCR确定At1g01880（AtGEN1）基因的组织表达差异性；并通（本文此处忽略..）过大肠杆菌原核表达系统获得包含599个氨基酸残基的AtGEN1蛋白，同时对纯化的目的蛋白进行酶活性特征检测，明确了AtGEN1的最佳作用温度、离子依赖性和底物特异性；另外，对候选基因中有T-DNA插入的拟南芥突变体植株进行了筛选并收获了不同突变株系的纯合体或杂合体种子。本研究主要获得以下实验结果：1.成功克隆到拟南芥解离酶候选基因At1g01880和At3g48900，它们所编码的蛋白均属于Rad2/XPG蛋白家族第Ⅳ亚类（人类和酵母中该亚类蛋白具有解离酶活性），并具有该蛋白家族保守的结构域：XPG-N、XPG-I、helix-hairpin-heli（略..）x。系统发育分析表明，植物GEN1-like蛋白分为三个进化枝：单子叶植物枝、双子叶植物枝、卷柏和苔藓枝。2．通过RT-PCR检测了At1g01880（AtGEN1）在哥伦比亚野生型拟南芥根、茎、叶、花4种组织的表达水平。结果表明，AtGEN1在这4种组织中都有表达，但是花中表达量远高于其他组织。3．原核表达结果显示，融合His蛋白标签的AtGEN1-His主要以包涵体形式存在，且表达量低。采取20℃低温培养和诱导，纯化到少量的融合蛋白，Westernblot鉴定显示，纯化到的AtGEN1-His融合蛋白，为所需目的蛋白。4.AtGEN1-His的酶活（本文此处忽略..）力分析表明，此蛋白的最适作用温度是30℃，Mg2+是保证其酶活力所必需的，其对底物5′-flap、RF有特异性的切割作用，并明确了AtGEN1对不同底物的最小作用浓度，而其对双链环状DNA没有随机切割活力，这些均与推断和文献报道一致，但是对Hj结构的底物（J3、X0）却没有特异性切割作用。去掉蛋白C端无序区并在N端融合MBP标签后，虽然蛋白可溶性有了明显增加，但未检测到核酸酶活力。5.利用PCR扩增，对4种具有T-DNA插入的拟南芥突变体株系进行筛选，从SALK-027797、SALK-106839两个株系中鉴定获得了纯合突变单株，从SALK-099116、SALK-（本文此处忽略..）135735两个株系中仅鉴定出杂合突变单株。水稻中GEN1同源基因OsGEN-L缺失会导致雄性不育，因而，SALK-099116、SALK-135735株系中未鉴定出纯合突变单株可能是AtGEN1突变引起育性下降所致。本研究首次表达纯化了拟南芥AtGEN1，并对其催化特性进行了系统分析，为该类酶在植物DNA重组和修复中功能的阐明奠定了基础。

以上为本篇毕业论文范文拟南芥AtGEN1的克隆、原核表达及其生物学功能的研究的介绍部分。

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