多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆与原核表达

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多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆与原核表达

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多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆与原核表达毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：脑多头蚴病是由多头带绦虫(TeaniaMulticeps)的中绦期幼虫脑多头蚴(Coenuruscerebralis)寄生于绵羊、山羊和牛等动物脑、脊髓内引起的一种严重致死性人兽共患病。该病呈全球性分布,在我国主要以西北等牧区常见,给畜牧业造成巨大的经济损失。目前本病的诊断主要是靠典型的临床症状,若能找到一种敏感性和特异性较好的抗原用于诊断,则对于脑多头蚴病的预防和治疗有非常重要的意义。本试验从脑多头蚴的原头蚴中提取出总RNA,参照已报道的猪囊尾蚴（本文此处忽略..）诊断抗原NC-3基因(AJ012669)设计了一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增出了一条约400bp的片段。测序结果显示Tm7基因与NC-3基因的相似性为97%,而与细粒棘球绦虫EpC1基因(AF481884)有83%的相似性。本序列包含NC-3基因完整的开放阅读框和EpC1基因的部分开放阅读框,编码由68个氨基酸组成的蛋白质,软件分析表明该蛋白质的分子量为约7.6kDa,等电点理论值为4.52,有较强的亲水性。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切将Tm7基因从pMD18-T载体上切下,插入原核表达载（略..）体pET32a(+),得到重组质粒pET32a(+)-Tm7,将其转入表达菌大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明,在相对分子质量约27kDa处可见目的基因与表达载体的融合蛋白,而对照组pET32a(+)空质粒菌在此处没有条带。该蛋白在IPTG浓度为0.25mmol/L时于37℃诱导表达4h达到表达量的最大值。经Ni-亲和层析柱纯化后,得到纯度较高的重组蛋白。免疫印迹试验表明,羊脑多头蚴病阳性血清能够识别该抗原,说明重组蛋白有反应原性。以多头带绦虫重组蛋白T（此处忽略..）m7作为包被抗原,羊脑多头蚴病阳性血清作为一抗,用HRP标记的兔抗羊IgG(HRP-兔抗羊IgG)为酶标二抗作间接ELISA来检测羊血清中的脑多头蚴抗体。通过对抗原包被浓度、抗体稀释度、二抗浓度、各步骤作用时间等的摸索,得出了重组抗原最适包被浓度为2.5μg/ml,血清稀释度为1：40,一抗最佳反应时间为1h,酶标二抗工作浓度为1：5000,反应时间为37℃45min,底物37℃显色15min。采用已确立的ELISA反应条件,检测了12份阴性羊的血清,依据阴阳临界值=阴性血清OD平均值+（本文此处忽略..）2SD,确定阴阳临界值为0.7。用此方法检测15份确诊为脑多头蚴病的羊血清,仅有1份OD值低于临界值,敏感性为93.3%；对12份阴性血清检测,均低于临界值,对5份细颈囊尾蚴病血清检测,有1例高于临界值。初步证明重组Tm7抗原有作为诊断抗原的潜力。

以上为本篇毕业论文范文多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆与原核表达的介绍部分。

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