油茶AACT基因和FAD6基因的全长cDNA克隆及原核表达

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油茶AACT基因和FAD6基因的全长cDNA克隆及原核表达

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毕业论文范文题目：油茶AACT基因和FAD6基因的全长cDNA克隆及原核表达，论文范文关键词：油茶AACT基因和FAD6基因的全长cDNA克隆及原核表达
油茶AACT基因和FAD6基因的全长cDNA克隆及原核表达毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：油茶是我国南方重要的木本油料树种,也是世界四大木本油料树种之一。茶油是优质的食用油,主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸组成,其含量一般在90%以上。在油脂合成过程中,乙酰辅酶A酰基转移酶(AACT)催化蛋白质的酰基化和去酰基化,而脂肪酸脱饱和酶6(FAD6)则控制油酸脱氢形成亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸。本研究在油茶种子cDNA文库和EST序列的基础上,通过油茶种子RNA提取、简并RT-PCR、RACE、生物信息学分析、原核表达等方法分离克隆了油茶AACT和FAD6基因的全长cDNA,并研究了其原核表达,为揭示油茶油脂合成规律和油茶的分子育种提供了理论依据和科学基础。主要研究结果如下：1.油茶AACT基因的全长cDNA克隆。通过序列分析从本实验室已构建的油茶近成熟种子EST文库中鉴定出一条油茶AACT基因,克隆编号为6155,总长度为1414bp,编码序列1159bp,含203bp的完整的3’端UTR(Untranslatedregion,非（本文此处忽略..）转录区)。通过Blast分析发现油茶AACT基因5’端缺失约14个氨基酸残基。在已知油茶AACT基因EST序列基础上,设计6条特异引物,以油茶优良无性系‘湘林1号’种仁总RNA为模板,通过反应体系和反应条件优化,最终通过AUAP/GSP2引物组合扩增出一条700bp左右的目的片段,将该片段回收、克隆、测序,获得718bp的cDNA序列,将该序列与油茶AACT基因进行序列拼接,确定了油茶AACT基因的全长cDNA序列,将该序列提交至GeneBank,登录号为GU594059。2.油茶AACT基因的生物信息学分析。油茶AACT基因全长cDNA序列为1495bp,含有一个1227bp的ORF,编码408个氨基酸残基；此外还含有长65bp的5＇端非编码区,长203bp的3＇端非编码区及一个polyA尾巴。在氨基酸序列水平上,该基因与胡黄连(P.kurrooa)的AACT基因的相似性最高,为86%,与稻瘟病菌(M.grisea)的最低,为65%。通过在线预测,油茶AACT基因编码蛋白的等电点（略..）pI为6.19,分子量Mw为41628.6Da,不稳定系数为25.73,属于稳定蛋白；该蛋白整体表现为疏水性,存在有极小几率的信号肽,是一个非分泌蛋白。次蛋白内含有40.44%的α-螺旋,15.44%的β折叠,具有6个不为明显的螺旋结构。模体搜索结果表明在AACT上具有两个硫解酶结构域,并存在多种N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、硫解酶活性位点等多个功能结构域。3.油茶AACT基因的原核表达。将测序为正确的重组克隆质粒(pMD18-AACT)用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切并回收后,与同样双酶切回收的PET28a相连接,转化至BL21感受态细胞中,得到的转化子经PCR鉴定和双酶切分析,筛选出符合正确阅读框的重组子,成功地构建重组表达质粒(pET28a-AACT),并得到了油茶AACT蛋白,分子量为41628.6Da,与预期分子量大小完全一致。4.油茶FAD6基因的全长cDNA克隆。根据GeneBank中已发布的FAD6基因的序列信息,通过核苷酸序列和氨基酸序列的多序列比对,在FA（文章此处忽略..）D6基因的保守区设计一对简并引物,以油茶优良无性系湘林一号种仁总RNA为模板,通过简并RT-PCR、回收、克隆、测序后,获得一条486bp的cDNA序列,Blast分析后确定该序列即为油茶FAD6基因部分序列,与茶树(Camelliasinensis)的CsFAD6基因相似性最高,为96%,仅有]1处碱基不同。根据茶树CsFAD6基因的全长cDNA序列信息,在包含起始密码子和终止密码子附近设计一对特异引物,通过RT-PCR、回收克隆、测序,成功获得一条长为1451bp的cDNA序列,序列分析确定该序列即为油茶FAD6基因的全长cDNA,并将该序列提交至GeneBank,登录号为GU594060。5.油茶FAD6基因的生物信息学分析。油茶FAD6基因ORF(OpenReadingFrame,开放阅读框)大小为1347bp,编码448个氨基酸残基；在氨基酸序列水平上,该基因与茶树(C.sinensis)的CsFAD6基因的相似性最高,为86%,与洋蓝蓟(E.gentianoi（本文此处忽略..）des)的最低,仅为36%。通过在线预测,油茶FAD6基因编码蛋白的等电点pI为8.67,分子量Mw为51382.3Da,不稳定系数为43.90,属于不稳定蛋白；具有两个跨膜结构域,没有信号肽切割位点,是一个非分泌蛋白。该蛋白内含有45.76%的α-螺旋,7.59%的β-折叠,可能存在4个螺旋结构。模体搜索结果表明在油茶FAD6上存在一个Cyt-b5(细胞色素5)结构域,并同时具有多种N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻磷酸化位点等多个功能结构域。

以上为本篇毕业论文范文油茶AACT基因和FAD6基因的全长cDNA克隆及原核表达的介绍部分。

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