油菜ATPS基因克隆、原核表达及其活性鉴定

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油菜ATPS基因克隆、原核表达及其活性鉴定

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毕业论文范文题目：油菜ATPS基因克隆、原核表达及其活性鉴定，论文范文关键词：油菜ATPS基因克隆、原核表达及其活性鉴定
油菜ATPS基因克隆、原核表达及其活性鉴定毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：油菜(Brassicanapus)是世界范围内重要的经济作物,是需硫量较高的作物之一。ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase,ATPS,EC2.7.7.4)广泛存在于动物、植物、微生物中,但它在各种生物体当中的生物学作用略有不同。ATP硫酸化酶,可催化ATP和SO42-生成APS和PPi,也可以催化此过程的逆反应;随着ATP硫酸化酶研究的深入,ATP硫酸化酶已从各种生物中提取得到,并已应用于商业生产之中。原核表达系统是目前最为成熟的表达系统。pET系统是在E.coli（此处忽略..）中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。故本研究采用常用的pET载体及大肠杆菌原核表达系统,试图获得大量目的蛋白。1997年NCBI公布了来自Brassicanapus的ATP硫酸化酶全长mRNA基因序列U28618,但是油菜ATP硫酸化酶在原核细胞中高效表达的研究目前尚未见报道。酵母ATP硫酸化酶现已经在原核中得到表达,并可应用于焦测序。为了进一步开发和研究ATP硫酸化酶,本文克隆了油菜‘秦优8号’的ATP硫酸化酶的cDNA序列,构建了高效的原核表达载体,采用包涵体纯化和复（略..）性技术得到了原核细胞表达的具有一定活性的油菜ATPS蛋白,为进一步研究油菜ATP硫酸化酶结构和特性奠定了实验基础。获得的主要研究结果如下:1.提取油菜‘秦优8号’叶片总RNA,以NCBI公布的油菜全长mRNA序列为基础,设计引物,应用RT-PCR的方法从油菜‘秦优8号’中克隆出了RATPS_8的含有完整ORF的cDNA序列,大小为1388bp,将其连入克隆载体pMD19-T后测序,测序结果比对推测其为叶绿体的ATP硫酸化酶基因片段。2.将RATPS_8连入pET-21a(+)表达载体中（此处忽略..）,得到了重组表达载体pET21a(+)-RATPS_8,再转化到原核细胞BL21(DE3)中,经鉴定得到了重组表达菌BL21-pET21a(+)-RATPS_8,并成功地实现了RATPS_8在大肠杆菌原核表达系统中的高效表达。将ATPS进行SDS-PAGE分析,切下目的蛋白,采用电洗脱法和丙酮沉淀法纯化ATPS蛋白。3.对包涵体形式表达RATPS_8的重组菌BL21-pET21a(+)-RATPS_8的培养及诱导条件进行了优化,提高了包涵体的产量,并对包涵体复性的条件进行了的探索。初步测定了重组油菜ATP硫（本文此处忽略..）酸化酶复性后的活性。结论:本试验克隆出了油菜‘秦优8号’的ATP硫酸化酶的cDNA序列,并成功的构建了重组原核表达载体,实现了油菜ATP硫酸化酶的高效重组表达;纯化了油菜ATPS蛋白,鉴定了油菜ATPS的活性,为测定油菜ATP硫酸化酶的表达部位和表达量提供一定的实验基础,也为油菜ATP硫酸化酶的结构和功能及其应用奠定理论依据。

以上为本篇毕业论文范文油菜ATPS基因克隆、原核表达及其活性鉴定的介绍部分。

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