华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造

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华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造

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毕业论文范文题目：华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造，论文范文关键词：华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造
华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：华根霉(RhizopuschinensisCCTCCM201021)作为一种典型的根霉属丝状真菌,不仅是传统酿造工业中的重要功能微生物,在现代发酵工业中也是许多工业用品和酶制剂的重要生产菌株。前期研究已经实现了华根霉脂肪酶基因(proRCL)(GenBankAccessionNo.EF405962)在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中的高水平分泌表达。本文在保留毕赤酵母诱导型启动子(AOX)两端同源重组序列的基础上插入组成型表达启动子(GAP),实现毕赤酵母组成型表达华根霉脂肪酶的作用。同时结合橄榄油罗丹明B平板,建立高通量的平板筛选法。选定脂肪酶盖子区域,运用半理性设计和理性设计的手段获得了一系列的活性和底物特异性改变的突变株,系统研究了盖子结构（此处忽略..）对脂肪酶活性和底物特异性的影响。具体内容包括:(1)运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。重组菌发酵144h后,脂肪酶最高酶活为130U/mL。(2)利用橄榄油罗丹明B平板建立高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。该方法将初筛时间从12d缩短为3d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。(3)根据半理性设计思路,选定pro（本文此处忽略..）RCL盖子结构域上连续10个氨基酸位点,利用重叠延伸PCR技术引入区域选择性突变,获得一系列酶活和底物特异性改变的突变酶。(4)根据理性设计思路,利用重叠延伸PCR技术将proRCLS4-3的盖子结构替换成米根霉脂肪酶(Rhizopusoryzaelipase,ROL),米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase,RML)和黑曲霉阿魏酸酯酶(AspergillusnigerFeruloylesterase,ANE)的盖子结构。获得突变酶proRCLS4-3O,proRCLS4-3M,proRCLS4-3N。(5)纯化后酶学性质与初始脂肪酶proRCLS4-3相比较,proRCLS4-3O对C12的特异性最高,kcat值几乎不变,km值增大一倍,甘油三（本文此处忽略..）酯酶和磷脂酶活力均有下降,热稳定性减弱。结合软件分析结果表明,Met213通过改变疏水通道口的大小直接影响酶与底物亲和力的大小,Thr216的作用则是通过与His229,Ala230的相互作用固定开盖构型。而突变Asn216使构象的不稳定性增加,最终导致突变脂肪酶的热稳定性减弱。(6)proRCLS4-3M对C8脂肪酸的特异性最高。kcat值增大5.6倍,km值几乎不变,同时甘油三酯酶活提高51%,蛋白质分子空间结构模拟显示GRAVY值升高一倍,说明盖子疏水性升高导致其与疏水性的底物的亲和力增加。同时底物与催化中心距离的缩短表明底物与催化中心的接触更紧密,kcat值增大。突变Ala209Trp引起底物进入酶活性中心通道的变窄,导致突变酶和中长链的pNPC8的结合更加紧密,特（文章此处忽略..）异性改变。(7)proRCLS4-3N对短链C2的特异性最高,kcat/km由2.80mM-1s-1明显下降为0.05mM-1s-1。甘油三酯酶活力与磷脂酶活力急剧下降。GRAVY值由原来的0.200下降为-1.086说明疏水性盖子替换成亲水性的盖子,破坏了催化中心的疏水环境,底物的催化效率降低,kcat值减小。N端糖基化位点使保持开盖构型,但盖子打开距离缩短,疏水性底物亲和性降低,底物特异性向短链脂肪酸靠近。

以上为本篇毕业论文范文华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造的介绍部分。

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