MicroRNA-221对结直肠癌中CDKN1C/p57表白的调控作用

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MicroRNA-221对结直肠癌中CDKN1C/p57表白的调控作用

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毕业论文范文题目：MicroRNA-221对结直肠癌中CDKN1C/p57表白的调控作用，论文范文关键词：MicroRNA-221对结直肠癌中CDKN1C/p57表白的调控作用
MicroRNA-221对结直肠癌中CDKN1C/p57表白的调控作用毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标本研究选用实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR)检测结直肠癌与毗连癌旁组织中miRNA-221表白状况,并以CDKN1C/p57为进一步的研究对象,再以半定量RT-PCR跟Western-blot分析CDKN1C/p57mRNA跟翻译后蛋白的表白状况,探讨miRNA-221对结直肠癌中CDKN1C/p57表白的调控作用,并为结直肠癌发病机制跟诊断医治的研究提供新的思路。方法1、组织来源：34例结直肠癌及对比癌旁组织标本取自我院2008年9月至2009年5月间手术患者,均经术后病检证明。其中男性20例,女性14例；年纪32～74岁,均匀(52.5±11.8)岁；结肠癌15例,直肠癌19例。癌旁组织取自间隔癌肿5cm的肠黏膜,另切取间隔癌肿10cm以上肠黏膜作为畸形对比。全部病例术前均未接收化疗或放疗。标本采集后敏捷放至液氮中冷冻,-80℃保存。2、引物设计与合成：由GeneBank查找基因序列,利用软件Primer-Express2.0进行引物与探针的设计。内参照RNU6B上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’,扩增产物长96bp;miRNA-221上游引物5’-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3’,下游引物为5’-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3’,扩增产物长73bp。上述引物均由上海生工合成。3、半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测：以miRNA-221及其调节的靶目标细胞周期蛋白依附性激酶克制因子CDKN1C/p57作为进一步研究对象。取上述步骤提取的总RNA3μg为模板,参照TaKaRa公司的RNAPCRKitVer3.0试剂盒阐明书行RT-PCR检测。CDKN1C/p57引物序列(片段长度500bp)为：上游5’-CGTTCTTCTCGGGTGGA-3’,下游5’-CTGTA（此处忽略..）CTCACTTGGCTCA-3’；内参照GAPDH引物序列(片段长度452bp)为：上游5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。PCR反应前提为：94℃2min；94℃30s、55℃30s、72℃1min,30个轮回；72℃10min。取PCR扩增产物10μL行1.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.5g/L溴化乙锭),用美国PharmaciaMasterImage紫外凝胶成像体系进行CDKN1C/p57mRNA表白程度的半定量分析。mRNA绝对含量=目标基因条带积分吸光度值／内参照GAPDH基因条带积分吸光度值。4、Real-timeQ-PCR检测标本中miRNA-221表白：惯例Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA,DEPC水溶解积淀,核酸蛋白分析仪(BeckmanCoulter,USA)测定RNA浓度,根据RNA在A260nm/A280nm≥1.8及甲醛变性凝胶电泳28S、18SRNA条带比值≥1.5鉴定RNA纯度及完全性。取总RNA1μg参加无菌蒸馏水12μL,混匀后72℃孵育5min以打开RNA二级构造,随后破即置于冰上,以避免RNA复性再次恢复二级构造；在另一去RNase的PCR管中配置以下反应液：dNTPmixture2.0μL、Rnase克制剂0.5μL、miRNA-221逆转录引物0.5μL、RNU6B逆转录引物0.5μL、5xbuffer4.0μL、M-MLV逆转录酶0.5μL(Promega公司)；配好后参加到方才含总RNA的溶液中混匀,42℃孵育60min,所得cDNA置于-20℃保存。构建miRNA-221跟RNU6B的Real-timeQ-PCR反应体系：cDNA5.0μL、Primers1.0μL、SYBRGreen荧光染料10μL、无菌蒸馏水8.0μL；反应前提：95℃变性10min；95℃15s、65℃30s、72℃30s,共40个轮回；轮回结束后72℃延长10min,每个标本均作复管（文章此处忽略..）PCR反应,至少反复三次(试剂购自TOYOBO公司,PCR仪采取ABIPRISM(?)7300)。5、PCR产物的定量校订跟断定分析：采取RNU6B作为内参照,用RNU6B的拷贝数作为校订基数,通过LightCycler软件直接获得各样本中miRNA-221的Ct(cyclethreshold)值,与同样本中RNU6B的Ct值相减,即获得该样本中miRNA-221的ΔCt值；因为以Real-timeQ-PCR来检测RNA时,受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效力的限度,咱们再以畸形肠黏膜的ΔCt值作为校订,得出-ΔΔCT值,按目标基因表白量=2-ΔΔCT公式打算各样本中miRNA-221确切切含量。6、Western-blot分析：组织块经预冷PBS漂洗2次,置于冰冷裂解液(含150mmol/LNaCl、50mmol/LTris-HCl[pH7.6]、0.1%SDS、1%NP-40跟蛋白酶克制剂复合物)中研磨匀浆后超声粉碎10min,1000rpm离心10min,弃去培养液,PBS荡涤；再1000rpm离心5min,弃上清,PBS荡涤：1000rpm离心5min,吸去PBS溶液,再根据细胞量参加相应的提取缓冲液,4℃轻摇15min,收集裂解液到EP管中,14000rpm离心15min；取50μg,总蛋白行SDS-PAGE并原位电转印至PVDF膜；膜经封闭液(含20mmol/LTris-HC1[pH7.6]、150mmol/LNaCl、0.1%Tween-20跟5%脱脂奶粉)处理后,与兔抗人CDKN1C/p57(稀释1：2000)跟内参照GAPDH(稀释：1：10000)的多克隆抗体分辨孵育,膜经漂洗后再与辣根过氧化物酶耦联的羊抗兔二抗(稀释1：5000)反应,加强化学发光法(ECL)发光试剂显影得到蛋白印记条带。一抗,二抗均购自Abeam公司。7、统计学处理：实验所得数据以均数±标准差(x±s)表示,采取配对设计两两比较t测验,以P0.05为差别有统计学意思,所有操作均以SPSS13.（本文此处忽略..）0统计软件实现。成果1、CDKN1C/p57的转录及翻译后产物：本实验首先对34例样本行半定量RT-PCR检测CDKN1C/p57mRNA表白。其中4例结直肠癌标本中CDKN1C/p57mRNA较癌旁组织表白明显降落,在进行下一步实验前将这些病例予以剔除(图1),余下30例样本(CDKN1C/p57mRNA在结直肠癌与癌旁组织表白差别无统计学意思)纳入后继研究。2、PCR产物的特异性：因为不同序列或长度的PCR产物在不同的温度下熔解,因此可察看到不同的峰值.当只有特异性的PCR产物构成时,在熔解曲线图中只可见单一的峰。Tm重要依附于片段长度、序列组成、GC含量跟反应中Mg2+浓度等因素。在本研究中,miRNA-221的PCR产物长73bp,其对应的Tm为84.26±0.56℃,熔解温度均一,峰的外形也较锋利。3、MiRNA-221在结直肠癌组织较癌旁组织中表白明显上调(2.041±1.401vs0.806±0.341),差别有统计学意思(P0.01)。4、30例结直肠癌标本中CDKN1C/p57蛋白较癌旁组织表白明显降落(3.019±1.708vs0.972±0.316),差别有统计学意思(P0.01)。MiRNA-221与CDKN1C/p57表白程度有负相干性(r2=0.9156,P0.01)。5、MicroRNA-221表白与TNM分期及浸润深度相干(P0.05)。论断1、MicroRNA-221在结直肠癌中表白程度明显高于毗连癌旁组织。在对结肠癌组织行半定量RT-PCR检测CDKN1C/p57mRNA含量时,发明11.8%(4/34)的样本中CDKN1C/p57mRNA含量存在低表白,合乎实验前提出的肿瘤细胞中存在母源等位基因甲基化印记缺失的假想,从而造成CDKN1C/p57mRNA在转录前已经表白下调,而并非因为miRNA-221的基因沉默机制引起。2、对残余样本进行半定量RT-PCR跟Western-blot检测分辨证明结直肠肿瘤组织与癌旁组织比拟,CDKN1C/p57mRNA表白程度差别无统计学意思,而蛋白产物表白量在结直肠肿（略..）瘤组织中明显降落。3、MicroRNA-221在结直肠癌中表白上调可能仅克制CDKN1C/p57mRNA的进一步翻译但不能将其基本降解,表示为CDKN1C/p57在mRNA程度结直肠癌组织跟癌旁组织中差别无统计学意思,而蛋白质程度在结直肠癌组织中表白明显降落,肿瘤细胞可能通过niRNA-221介导的CDKN1C/p57转录后基因沉默而获得浸润转移才能。4、MicroRNA-221差别表白状况可为结直肠癌早期筛查、病理分期、领导医治、复发检测提供临床利用价值。

以上为本篇毕业论文范文MicroRNA-221对结直肠癌中CDKN1C/p57表白的调控作用的介绍部分。

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