东方马脑炎病毒E2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

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东方马脑炎病毒E2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

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毕业论文范文题目：东方马脑炎病毒E2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定，论文范文关键词：东方马脑炎病毒E2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
东方马脑炎病毒E2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：东方马脑炎（Easternequineencephalitis,EEE）是由东方马脑炎病毒（Easternequineencephalitisvirus,EEEV）引起的一种典型的发病急、传染性强、致死率高的人兽共患病毒性疾病。EEEV属于披膜病毒科甲病毒属，卫生部将其列为第一类病原微生物。在美洲地区广泛流行，我国仅在1991年分离到EEEV，2003年在福建省的临床病例中发现有EEEV的感染者，但是至今尚无有关EEE流行的报道。随着全球气候与生态环境的改变、国际贸易的发展以及潜在生物恐怖袭击危险系数的增加，建立针对上述病毒快速准确的鉴别诊断方法并进一步研究防治措施十分必要。本研究首先根据GenBank中EEEV北美分离株（NorthAmerica,NA,登录号（文章此处忽略..）X63135.1）的E2基因分别设计引物，以实验室保存的EEEV-cDNA为模板，通过PCR扩增获得E2基因，双酶切后将E2基因分别克隆至原核表达载体pET-30a、Bac-to-Bac真核表达载体pFastBacTMHTA以及真核表达载体pShuttle-CMV中，构建重组质粒pET-E2、pFast-E2与pShuttle-E2。将pET-E2转化E.coliBL21，37IPTG诱导表达E2蛋白。SDS-PAGE结果显示原核重组E2蛋白大量表达并使用Ni2+NTA树脂对其进行了纯化，蛋白浓度可达1.51mg/mL。Westernblot（WB）表明重组E2蛋白能与HRP标记的抗6×His标签的单克隆抗体（MAb）发生特异性反应。将pFast-E2转化E.coliDH10BacTM，提取重组杆粒BAC（文章此处忽略..）-E2。将BAC-E2转染Sf9昆虫细胞，得到携带E2基因的重组杆状病毒BACV-E2。SDS-PAGE结果显示重组E2蛋白成功表达并以包涵体形式存在，利用Ni2+NTA树脂对其进行变性纯化，蛋白浓度可达1.36mg/mL。WB表明该重组E2蛋白能与HRP标记的抗6×His标签的MAb发生特异性反应。以Bac-to-Bac真核表达系统表达纯化的重组E2蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以原核表达纯化的重组E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，获得51株稳定分泌抗E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株。WB结果显示，51株MAbs与EEEVE2蛋白均呈阳性反应。采用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行IFA显示51株MAbs均呈阳性反应，而采用（此处忽略..）重组真核质粒pShuttle-E2转染BHK-21进行IFA显示45株MAbs呈阳性反应，而MAbs5B6、5F4、6G2、7C3、3D11、3E5则表现为阴性反应。将E2蛋白截短表达为42条短肽，利用肽扫描进一步确定E2蛋白的抗原表位，利用肽ELISA与WB对51株MAbs扫描共获得9个线性表位；另有5株MAbs3D11、3E5、6F3、7D5、7G6无相应短肽与其对应，推测为构象表位。与甲病毒属的其它病毒表位区序列进行比对并根据比对结果合成相应短肽利用肽ELISA进行特异性鉴定，获得7个EEEV特异性表位，其中4个EEEV抗原群（EEEVⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型）特异性表位（1-16aa、248-259aa、271-286aa、321-336aa），3个EEEV型特异性表位（Ⅰ型特异性表位108-119aa，Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型特异性表位231-246aa与Ⅰ/Ⅳ型特异性表位211-226aa）；2个EEEV/VE（文章此处忽略..）EV（VenezuelanequineencephalitisVirus，委内瑞拉马脑炎病毒）特异性表位（131-146aa、241-256aa）。本实验共制备获得51株抗EEEVE2蛋白的MAbs，鉴定获得9个抗原表位并对表位的特异性进行了初步鉴定，这些都为E2蛋白结构与功能的研究以及表位疫苗与标记疫苗的研制奠定了基础，同时对于EEEV的鉴别诊断也具有重要意义。

以上为本篇毕业论文范文东方马脑炎病毒E2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定的介绍部分。

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