应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的研究

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应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的研究

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毕业论文范文题目：应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的研究，论文范文关键词：应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的研究
应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目的:性别信息是法医检案过程中及考古研究过程中最重要的信息之一。通常在尸表保存完整的情况下,法医工作者可以通过形态学分析做出判定。然而面对重大群体性灾难事件中人的骨架完整性被破坏,或者由于小孩骨骼发育不全导致形态学分析难以得出鉴定结论时,分子水平的鉴定方法就显得尤为重要了。目前,常用的进行性别鉴定的DNA技术主要包括,Y染色体的特异性探针、锌指蛋白(ZFY/ZFX)基因和牙釉质蛋白基因(Amelogeningene,AMEL)的检测,其中对牙釉质蛋白基因的检测应用得最为广泛。自1991年,Nakahori等人对牙釉质蛋白基因进行测序后,Nakahori(1991)、Akane(1991)、Bailey(1992)、Sullivan(1993)先后用PCR扩增单拷贝X、Y同源区域进行性别测定。目前Sullivan法应用得最广泛,在多个法医个人识别试剂盒中做为性别鉴定的方法,其扩增片段为106bp和112bp。然而,对于一些高度腐败降解的生物检材,以及由（此处忽略..）于AMEL序列突变及性染色体变异造成的“无效扩增”,现有的检测技术往往不能获得明确的分型结果。针对这一问题,本研究建立了一种新的性别DNA分析方法,即应用焦磷酸测序技术分析牙釉质蛋白基因45bp的DNA片段,并对该方法的灵敏度,种属特异性,降解模型,骨骼样本等法医学应用进行初步研究,以期为一些疑难案件的性别鉴定提供参考。方法:⑴根据Genebank上提供的AMELX和AMELY的核苷酸序列通过Blast进行比对后,选择一段含有3个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点及1个插入/缺失位点的序列作为待测靶序列。用Primer5和Oligo6等引物设计软件设计扩增引物和测序引物,一条扩增引物标记生物素;利用焦磷酸测序软件建立预期模型;对反应体系中的引物浓度、Mg2+浓度、退火温度和循环次数等条件进行优化,选择最佳反应条件进行PCR扩增,应用焦磷酸测序（文章此处忽略..）技术对PCR产物进行测序,根据测序结果判定性别。应用该方法对100份已知性别(男女各50份)的中国汉族健康无关个体进行测序分析,验证本方法的可靠性和准确性。⑵选取男女两份DNA样本,定量后稀释为1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng和0.0625ng进行灵敏度检测;应用本方法对猴、狗、兔、猪、牛、鱼、鸡的DNA样本以及大肠杆菌、肠球菌、念珠菌的菌株进行分析,验证其种属特异性;将新鲜血液放置于6月-11月的自然环境中26周模拟高度降解检材,用DNaseI制备人工降解DNA,应用本研究构建的方法及商品化AmpF/STRIdentifilerTM试剂盒分别对其进行性别分析,比较二者的成功率;提取骨骼样本DNA,应用本方法对骨骼DNA进行分析。结果:⑴成功构建了应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的方法。本方法的扩增片段包含上下游引物在内只有45bp,同时包含了多个点突变和插入缺失突变。焦磷酸测序图清晰、直观、容（文章此处忽略..）易判型。应用本方法对100份已知性别个体DNA的检测分析显示,所有样本均能得到清晰的分型结果,与预期模型无异,分型结果准确。⑵法医应用评估:①本方法能够正确分型的最低DNA模板量为1ng,具有较高的灵敏度;②在检测的所有动物及菌株中,应用本方法进行分析,除在恒河猴检出产物峰外,其余常见动物和微生物均未检测到特异性产物峰,具有较好的人类种属特异性;③对8份降解26周的血液检材进行分析,本方法均得到了清晰正确的分型结果,而应用IdentifilerTM试剂盒检测,6份样本分型明确,2份样本分型失败;④对DNaseI制备的降解DNA进行分析,本方法对DNaseI消化5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min的DNA均能正确分型,测序结果非常清晰,而IdentifilerTM试剂盒仅能对DNaseI消化5min、10min的DNA进行正确分型,且牙釉质蛋白基因产物峰的相对荧光单位(Rfu)较低,对消（本文此处忽略..）化15min及更长时间的DNA均未得到产物峰,分型失败;⑤对6份来自4种不同部位的骨骼进行DNA的提取和分析,除牙齿由于取材量少导致分型失败外,其余5份骨骼DNA均得到清晰的分型结果。结论:本研究建立了一种应用焦磷酸测序技术检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的方法,扩增产物仅为45bp,操作简单、快捷、通量高、成本较低;检测的靶位点包括3个点突变位点和1个插入缺失位点,保证了良好的准确性和稳定性;灵敏度达1ng,具有较好的人类种属特异性;对高度降解检材的检验成功率明显高于常规方法。综上,本方法对于高度降解检材或古DNA的性别鉴定,以及大规模样本调查具有较好的应用价值。

以上为本篇毕业论文范文应用焦磷酸测序技术检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的研究的介绍部分。

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