转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究

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转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究

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毕业论文范文题目：转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究，论文范文关键词：转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究
转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)可被诱导分化为多种细胞,被认为是组织工程种子细胞的重要来源。在体外培养时,hBMSCs寿命有限,随传代次数增加其分化能力逐渐丧失,这限制了其在组织工程中的研究和运用。转基因技术迅速发展,使永生化细胞建立成为可能。本研究通过逆转录病毒载体将外源人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转入人骨髓间充质干细胞中,以建立永生化的人骨髓间充质干细胞。方法通过脂质体将含有hTERT基因的逆转录病毒载体(pLEGFP-C1-hTERT)转入包装细胞PT67,G418筛选出表达病毒的阳性细胞克隆。选取3个细胞克隆,各自进行扩增培养。通过NIH3T3对选取细胞的上清（本文此处忽略..）进行病毒滴度测定,确定最高病毒滴度。提取并扩增hBMSCs,用病毒滴度最高的上清感染第三代(P3)hBMSCs。G418筛选感染后的细胞,选取3个单克隆分别进行扩增培养。通过RT-PCR和WesternBlot测定hTERT基因是否转入hBMSCs中并表达。对P3转导后的hBMSCs(hTERT-hBMSCs)在形态学,细胞表型,向软骨细胞诱导方面研究证明hTERT-hBMSCs仍保持转导前的特性。通过MTT法测绘转导前后hBMSCs生长曲线,观察hTERT基因转入后对细胞增殖的影响。通过TRAP-ELISA对hTERT-hBMSCs中端粒酶活性进行检测;通过平板克隆形（此处忽略..）成实验和裸鼠致瘤实验对hTERT-hBMSCs致瘤性方面进行研究。结果通过RT-PCR和WesternBlot检测,转导后hBMSC中有hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表达,而未转导hBMSC中虽可测到hTERT基因弱的mRNA转录,但是没有测到蛋白的翻译。hTERT-hBMSCs在形态学上和hBMSC一样呈长梭形,但是由于转导有EGFP基因,前者有绿色荧光蛋白表达。通过流式细胞仪检测转导前后hBMSC表面抗原标记:CD29,CD71,CD106,CD45和CD34,结果为前三项抗原都是阳性,后两项为阴性。在功能学方面,通过向软骨细胞诱导,免疫细胞化学检测到转导前后的（文章此处忽略..）细胞都呈棕黄色,说明有软骨细胞特异性标记II型胶原蛋白表达。TRAP-ELISA检测到hTERT-hBMSCs中端粒酶活性,而没有测到未转导hBMSC中端粒酶活性。hTERT-hBMSCs增殖能力增加,现其传代数在50代以上。在体外平板克隆培养中,hTERT-hBMSCs和hBMSCs细胞克隆形成不仅数量少,而且细胞生长状态差,克隆形成率为0.83%和0.67%,低于正常细胞克隆形成率1%,而对照组恶性黑色素瘤细胞克隆数量多,细胞生长状态好,克隆形成率为57.4%,远远高于肿瘤细胞克隆形成率10%。在裸鼠致瘤实验中,阳性对照恶性黑色素瘤细胞接种于裸鼠背部皮下,三周后局部就形成的肿块,HE（略..）染色为恶性黑色素瘤细胞,而注射有hTERT-hBMSCs的部位观察两月未见肿物形成,局部皮下组织HE染色为皮下疏松结缔组织。结论hTERT基因成功导入hBMSCs后不改变hBMSCs细胞形态,表面标记和分化功能,保持其向软骨细胞分化的能力。hTERT基因转入使hBMSCs端粒酶活性被激活,其细胞寿命延长。hTERT基因转入使hBMSCs没有向恶性转化。研究证明成功地建立功能正常的永生化hBMSCs,可为组织工程种子细胞的来源提供一种途径。

以上为本篇毕业论文范文转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究的介绍部分。

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