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慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的

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毕业论文范文题目:慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的,论文范文关键词:慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的
慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】:实验背景:在从前的70年中,电子起搏器在心脏传导阻滞性疾病(病窦综合征、房室传导阻滞等)及固执性心力衰竭、心室抖动等的医治方面救命了大量患者的生命。然而它也逐步裸露出一些毛病:电池寿命有限(8~10年)、非生感性次序冲动、一些难以避免的并发症(感染、出血、心肌穿孔、电极脱位)等等。从心脏的生理功能跟人体适应性的角度,幻想的起搏器应当是“生物起搏器”。现有的生物起搏方法重要包含基因生物起搏及细胞生物起搏。前者重要集中在3个基因医治策略上:①上调心肌细胞膜上的β2肾上腺素能受体表白;②克制Kir2基因家族编码内向整流电流Ik1通道;③上调心肌细胞起搏电流的α(HCN2)跟β(MiRP1)亚单位基因。但目前这些研究尚未获得冲破性进展,且上述生物起搏靶基因也不是窦房结细胞主动去极化的特异性调控基因。大量研究表明,由超极化激(略..)活的环核苷酸门控通道基因超家族编码的起搏电流(If),在窦房结起搏细胞舒张期主动除极化过程中发挥着至关重要的作用。If通道家族共有4个成员,即HCN1~HCN4,其中HCN4在窦房结中表白最高,是调控If电流及保持窦房结起搏细胞电生理功能的特异性基因,是一种幻想的生物起搏靶基因。骨髓间充质干细胞(MSCs)存在多向分化潜能及其对外源基因的高转染效力跟高效牢固表白,不少学者利用MSCs的上述特点将其作为基因转染的细胞平台,导入目标片段基因,把细胞工程跟基因医治进行有机结合。例如,将mHCN2转染到骨髓间充质干细胞,发明MSCs能产生高程度的类似If的电流;将转染了mHCN2起搏基因的MSCs进行体内移植,可明显进步心室的“自律性”。然而HCN2亚型的生理功能在于牢固静息状况下起搏细胞的舒张期膜电位(文章此处忽略..),从而起到牢固起搏节律的作用,而对活动跟交感刺激状况下的节律牢固性则无明显影响;而HCN4不仅对产生畸形起搏电位跟基本心率至关重要,而且也参加交感神经对心率的调节作用。研究目标:咱们假想以hHCN4为生物起搏的靶基因,利用猪骨髓间充质干细胞(MSCs)作为细胞生物起搏的平台,通过慢病毒载体转染以获取牢固高表白hHCN4基因的MSCs,并对转染细胞的起搏通道蛋白的表白及If电流能源学特点进行检测,为树破新型有效的细胞生物起搏医治奠定实验基本。研究方法:1.猪间充质干细胞的分别与纯化采取密度梯度离心法分别纯化猪骨髓间充质干细胞,培养采取直接贴壁法培养;用倒置显微镜进行活细胞状况学的动态察看。2.慢病毒hHCN4基因转染MSCshHCN4慢病毒载体(Lentiv-EGFP-hHCN4)跟不含hHCN4的慢(本文此处忽略..)病毒对比载体(Lentiv-EGFP)对第2代MSCs进行转染。荧光显微镜察看绿色免疫荧光蛋白表白情况;免疫组化染色检测hHCN4蛋白表白情况;3.Westernblot印迹检测hHCN4转染MSCs各组的hHCN4通道蛋白表白情况;4.全细胞膜片钳技巧对重组hHCN4通道进行能源学测定。研究成果:1.倒置显微镜可见,经原代培养的MSCs多数为成纤维样的梭形细胞,呈克隆样成长;2.成功将hHCN4慢病毒载体(Lentiv-EGFP-hHCN4)跟不含hHCN4的慢病毒对比载体(Lentiv-EGFP)转染至猪MSCs,获得了牢固表白hHCN4基因的MSCs。3.荧光显微镜可见,两组绿色荧光蛋白表白及分布无明显差别,转染效力约为90%。4.转染后免疫细胞化学染色可见,hHCN4组细胞hHCN4抗体染色为阳性,GFP组及对比组细(文章此处忽略..)胞则呈弱阳性;5.Westernblot印迹检测可见hHCN4组有一公约170kDa的条带,而GFP组及对比组条带不明显;6.全细胞膜片钳技巧记录到IHCN4,得到电流密度-电压曲线,其激活电压约为-70±5mV,此电流可能被4mmol/LCsCl阻断。GFP组跟对比组的MSCs细胞均无IHCN4。论断:1.密度梯度离心法可能成功分别纯化猪骨髓间充质干细胞。2.以hHCN4作为生物起搏的靶基因,通过慢病毒载体可能成功转染MSCs,并表白通道蛋白。3.转染后的MSCs表白的hHCN4通道与生感性起搏离子流畅道存在雷同的能源学特点。


以上为本篇毕业论文范文慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的的介绍部分。
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