固氮斯氏假单胞菌A1501泌铵突变株的构建及其理化特性

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固氮斯氏假单胞菌A1501泌铵突变株的构建及其理化特性

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毕业论文范文题目：固氮斯氏假单胞菌A1501泌铵突变株的构建及其理化特性，论文范文关键词：固氮斯氏假单胞菌A1501泌铵突变株的构建及其理化特性
固氮斯氏假单胞菌A1501泌铵突变株的构建及其理化特性毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：联合固氮菌与宿主根系形成松散的结合方式,所固定的氮主要供自身生长所需,只能为植物供给有限的氮素。因此,探索联合固氮菌的泌铵机制,提高其固氮和泌铵能力,在理论和实际应用上有着重要意义。本研究在完成了斯氏假单胞菌A1501全基因组测序和注释信息,以及开展联合固氮菌固氮基因调控表达的研究基础上,构建了具有能高效固氮的泌铵工程菌,并进行了生理生化特性分析。根据斯氏假单胞菌A1501的基因组序列,克隆了固氮酶正调节基因(nifA),将含有完整的nifA的DNA片段连接到pVK100,构建了nifA组成型表达质粒pVA3,通过三亲结合的方法将pVA3转化进铵转运载体蛋白AmtB1AmtB2双缺失突（略..）变株(1561)和野生型菌株中,经卡那霉素(Km)和四环素(Tc)抗性筛选,分别获得1561/pVA3和A1501/pVA3重组菌。研究结果表明增强nifA基因的表达提高了固氮条件下斯氏假单胞菌的固氮酶活,而且在一定铵浓度(10mM)下也能保持固氮能力(1.53U/mg·protein)。但是,未观测到A1501/pVA3培养物中铵离子的存在。尽管铵转运载体缺失突变株(1561)在固氮条件下的固氮酶活略高于野生型菌株,但无显著性差异,在10mM铵浓度下均未测定到固氮酶活。然而,在以硝酸盐为唯一氮源时,A1501培养液中测定不到铵离子的存在,而菌株1561在含8mM,12mM硝酸盐的培养基中经33h培养后,培养液中的铵浓度分别达到0.60mM和1.32mM。结果表明硝酸盐进（本文此处忽略..）入细胞后转化为铵,经自由扩散到胞外,当铵转运载体蛋白缺失时,不能迅速将铵吸收到胞内,从而导致胞外含有铵离子。nifA组成型表达且铵转运载体蛋白缺失的斯氏假单胞菌突变株(1561/pVA3)在固氮条件下,其固氮酶活(14.24U/mg·protein)是野生型的1.95倍,在10mM铵浓度下仍然保持一定的固氮酶活(4.24U/mg·protein),高于A1501/pVA3的酶活。在无氮的半固体限制性培养基中培养15天后,培养基呈弱碱性(pH=7.42),测定培养基的铵含量达5.15mM。研究结果表明1561/pVA3具有较强的固氮能力,并且能向胞外泌铵。1561/pVA3和野生型菌株的水稻接种实验显示,接种工程菌的水稻株高(19.4cm)、地上、地下部分干（此处忽略..）重(12.85mg和2.96mg)等指标都要高于接种野生型A1501的水稻(14.8cm,11.70mg和2.11mg)。根表竞争实验表明1561/pVA3在水稻根际的定殖和根际竞争能力上优于野生型。本研究结果表明工程菌对水稻具有较好的促生作用。上述结果显示1561/pVA3菌株是具有较强固氮能力和具有泌铵能力的工程菌。为进一步探讨1561/pVA3的泌铵作用,我们对工程菌及野生型菌株进行了铵冲击试验,铵离子、硝酸盐、氨基酸含量和GS酶活的测定,以及固氮和非固氮条件下固氮基因转录表达测定,结果表明1)nifA的组成型质粒pVA3增强了nifA基因的表达效率,从转录水平上增强了固氮基因的表达;2)铵转运载体基因amtB1amtB2的缺失使得1561/pV（本文此处忽略..）A3失去了向细胞内部主动运输铵的能力,使固氮合成的铵通过自由扩散在胞外积累;3)AmtB1AmtB2可能参与了固氮酶的后修饰和调控固氮基因的表达,并在蛋白的翻译水平上增强了固氮酶的合成效率。

以上为本篇毕业论文范文固氮斯氏假单胞菌A1501泌铵突变株的构建及其理化特性的介绍部分。

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