恶性疟原虫融合蛋白PfCP-5的构建及其免疫原性研究

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恶性疟原虫融合蛋白PfCP-5的构建及其免疫原性研究

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毕业论文范文题目：恶性疟原虫融合蛋白PfCP-5的构建及其免疫原性研究，论文范文关键词：恶性疟原虫融合蛋白PfCP-5的构建及其免疫原性研究
恶性疟原虫融合蛋白PfCP-5的构建及其免疫原性研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：疟疾目前仍是一种危害严重的虫媒传染病。全球每年约有3-5亿疟疾病例,其中约300万病人死于恶性疟,大多为五岁以下的儿童。随着疟原虫对抗疟药物以及蚊媒对杀虫剂抗性的产生和扩散,疟疾防治面临很大的困难,因此研究和开发有效的疟疾疫苗已成为防治疟疾潜在的新的途径。疟原虫子孢子通过疟蚊叮咬进入人体后,并侵入肝细胞发育繁殖,产生裂殖子释放入血,并侵入红细胞生长繁殖。阻断疟原虫裂殖子入侵红细胞是抑制红内期原虫生长的重要环节,也是红内期疫苗的主要靶点。研究表明,裂殖子入侵红细胞是由受体和配体介导,位于裂殖子表面的蛋白可能参与该入侵过程,是疫苗研究潜在的靶抗原。本研究旨在研究恶性疟原虫裂殖子表面蛋白(MerozoiteSurfaceProteinMSP)3、4和5的免疫保护功能。MSP3是裂殖子的一个外分泌蛋白,其免疫作用是通过ADCI机制抑制疟原虫生长。研究表明该蛋白的免疫保护功能位于氨基酸第184-210(MSP3b),203-230(MSP3c)和211-252位(MSP3d),每个区域至少含有一个B细胞和一个T细胞表位,抗MSP3b的抗体通过ADCI效应机制在体外有效杀灭疟原虫。抗MSP3c和MSP3d抗体在体外有较强的ADCI作用,抑制原虫生长。因此MSP3第184-252位的69个氨基酸残基片段是其保护性免疫的功能片段。MSP4是通过GPI位于裂殖子表面的蛋白质,其C末端含有EGF样结构域。MSP5与MSP4高度同源,并在其C末端含有EGF样结构域。针对这两个蛋白EGF区域的抗体在体外能部分抑制疟原虫（此处忽略..）生长。本研究将上述3个裂殖子表面蛋白的功能区域,即MSP4C-末端EGF区域(MSP4D,第204-248位氨基酸片段)、MSP3的69个氨基酸片段和MSP5C-末端EGF区域(MSP5D,第208-251位氨基酸片段)融合组成一个融合抗原,定名为恶性疟原虫融合蛋白5(PlasmodiumfalciparumChimericProtein5,PfCP-5)。从GenBank获得3D7株恶性疟原虫各片段的序列,并按以下次序排:MSP4D-MSP3-69-MSP5D。按照毕氏酵母密码子使用频率对PfCP-5基因序列进行重新设计,并将第86位的N→Q排除一个糖基化位点。在基因的两端加上合适的酶切位点XhoI/EcoRI,以及在3’端加上6个His的TAG以便后续蛋白的纯化。人工全合成PfCP-5基因。将合成基因插入过渡载体pPIC9,从而将目的基因前端加上分泌表达的信号肽序列,进而转到表达载体pPIC9K,酶切线性化后电转毕氏酵母。挑取经G418筛选的克隆进行甲醇诱导表达。Westernblotting鉴定目的蛋白的表达。采用15升罐进行发酵表达,用Ni-NTA亲和纯化,获得较高纯度的目的蛋白用于后续的动物免疫实验。此外,为纯化MSP3特异的抗体,我们在大肠杆菌中表达了GST-MSP3-69融合蛋白,并分离纯化了该蛋白。动物免疫实验分为ISA720佐剂组、弗氏佐剂组、氢氧化铝/CpG1826联合佐剂组、ISA70MVG佐剂组和ISA206佐剂组。纯化的PfCP-5蛋白与佐剂乳化后免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠,每个蛋白佐剂组（本文此处忽略..）6只,相应的PBS佐剂对照6只,每只每次免疫20μg蛋白,免疫体积为100μl,皮下注射免疫三次,间隔两周,每次免疫后第8天尾静脉取血。免疫血清用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫血清的特异抗体滴度,并进行抗体亚型的分析。结果表明:血清抗体滴度在1/200,000-1/765000范围,其中氢氧化铝/CpG联合佐剂组抗体滴度最高为1/76.5×104,其次是弗氏佐剂组抗体滴度为1/55.2×104,再次ISA720佐剂组抗体滴度为1/48.9×104,ISA70MVG和ISA206组最低,滴度分别在1/25.3×104和1/20.9×104。氢氧化铝/CpG联合佐剂组,弗氏佐剂组和ISA720佐剂组三组抗体滴度之间没有差异(p0.05),但是三个佐剂组依次分别是ISA70MVG组的3.0倍,2.18倍和1.93倍,同时,分别是206佐剂组的3.66倍,2.64倍和2.33倍。为检测免疫血清能否识别疟原虫天然蛋白,我们以体外培养的恶性疟原虫为抗原,采用间接免疫荧光抗体试验(IFA)进行检测。结果表明,PfCP-5抗体能与疟原虫天然蛋白反应。IFA结果显示:氢氧化铝/CpG联合佐剂组、ISA720佐剂组、弗氏佐剂组、ISA70MVG佐剂组和ISA206佐剂组在同是1:100稀释时,氢氧化铝/CpG联合佐剂组、ISA720佐剂组、弗氏佐剂组阳性较强,而ISA70MVG佐剂组和ISA206佐剂组阳性较弱。抗体亚型分析结果显示,IgG1抗体滴度最高达1/106,IgG2a为其次,最后是IgG2b及IgG3,分别为1/1.2×104和1/0.9×104。采用新西兰白兔为接种动物,实验分为ISA720佐剂组、弗氏佐剂组及氢氧化铝/CpG(CpG2007)联合佐剂组。每组家兔3只,每只每次皮下注射（此处忽略..）100ug蛋白,注射体积为1ml,间隔三周,免疫三次,每次免疫后第8天取血,ELISA检测血清抗体滴度结果显示:其中ISA720佐剂组最高滴度达1/102×104,弗氏佐剂组在1/72.7×104,氢氧化铝与CpG联合免疫组1/25.2×104,三者之间比较存在显著差异(p0.01)。此外,用大肠杆菌表达GST-MSP3-69融合蛋白,经与ISA720佐剂、弗氏佐剂、氢氧化铝/CpG(CpG1826)联合佐剂分别乳化后免疫BALB/c小鼠。三次免疫后血清ELISA检测抗体滴度分别为1/138×104,1/116×104和1/72.5×104。用恶性疟原虫FCC1/HN株进行体外抑制试验,结果表明抗PfCP-5的免疫血清没有明显抑制疟原虫生长的作用。用纯化的PfCP-5和GST-MSP3-69为抗原,制备Sepherose4B-PfCP-5和Sepherose4B-GST-MSP3-69亲和柱进行特异抗体的分离。用亲和纯化的特异抗体进行体外抑制试验,结果表明在纯化兔抗IgG在终浓度为1.25mg/ml时没有明显抑制原虫生长作用。然而,在单核细胞存在的情况下,抗PfCP-5IgG终浓度为1.25mg/ml时,抗PfCP-5IgG和抗GST-MSP3-69IgG抑制率分别在68%和51.5%。综上所述:本研究构建了PfCP-5融合基因并在毕氏酵母真核表达系统中产生融合蛋白PfCP-5;构建并表达了MSP3(184-252)片段和GST-MSP3-69融合抗原。动物免疫实验表明,这些抗原具有较强的免疫原性,对不同佐剂免疫实验表明在小鼠体内氢氧化铝/CpG(CpG2007)联合佐剂能诱导较强的免疫应答反应。不同佐剂组免疫小鼠血清均（此处忽略..）能识别体外培养的疟原虫,表明诱导产生针对天然构象表位的抗体。在没有单核细胞存在情况下,抗PfCP-5特异IgG和抗GST-MSP3-69特异IgG没有明显抑制疟原虫生长的作用,但在单核细胞存在的情况下,抑制率分别在68%和51.5%。本试验为后续实验纯化疟疾流行区针对PfCP-5人抗IgG进行该蛋白的功能评价及将PfCP-5或MSP3-69插入本实验室已经构建的疟疾候选疫苗PfCP-2.9中以提高其免疫保护效力提供实验依据。

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