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高迁移率族蛋白B1影响小鼠调节性T细胞免疫功能的受体机制研究

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毕业论文范文题目:高迁移率族蛋白B1影响小鼠调节性T细胞免疫功能的受体机制研究,论文范文关键词:高迁移率族蛋白B1影响小鼠调节性T细胞免疫功能的受体机制研究
高迁移率族蛋白B1影响小鼠调节性T细胞免疫功能的受体机制研究毕业论文范文介绍开始:
【论文摘要】:目的:通过体外实验观察高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox-1protein,HMGB1)刺激对调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)免疫活性相关指标表达水平的影响,初步探讨HMGB1影响CD4~+CD25~+Treg免疫功能的可能受体机制;采用不同基因型动物进行体内实验,进一步明确HMGB1影响CD4~+CD25~+Treg免疫功能是否通过Toll样受体起作用。方法:①采用免疫磁珠法分离获取正常C3H/HeN(Toll样受体4野生型)小鼠脾脏CD4~+CD25~+Treg,鉴定细胞纯度,调整细胞浓度1×10~6/孔后置于含10%小牛血清的1640培养液的96孔培养板。②将CD4~+CD25~+Treg随机分4组,依HMGB1(100ng/ml)刺激时间不同设为对照组、24h组、48h组、72h组,观察HMGB1刺激与Toll样受体4(TLR4)表达的时间-效应关系;依HMGB1刺激剂量的不同设为0ng/ml组(对照组)、10ng/ml组、100ng/ml组、1000ng/ml组,作用48小时后用流式细胞仪分析CD4~+CD25~+TregTLR4的表达情况(剂量-效应关系),同时分别留取细胞培养上清,ELISA法测定IL-10的变化情况。③以功能纯化级抗-TLR4抗体(浓度2μg/10~6ce(此处忽略..)ll)预封闭C3H/HeN小鼠CD4~+CD25~+Treg,观察HMGB1刺激对CD4~+CD25~+Treg表达T淋巴细胞毒性相关抗原4(cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4,CTLA-4)及叉头翼状螺旋转录因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor,Foxp3)水平的影响。分组情况:时间-效应关系实验中,设正常对照组、24h组、48h组和72h组;剂量-效应关系实验中,设空白对照组、10ng/ml组、100ng/ml组和1000ng/ml组。收获细胞时留取细胞培养上清,ELISA法测定上清中IL-10浓度的变化情况。④将HMGB1以10μg/只、20μg/只的剂量分别腹腔注射C3H/HeN(TLR4野生型)小鼠和C3H/HeJ(TLR4突变型)小鼠体内,48h后提取两种小鼠脾脏CD4~+CD25~+Treg,继续体外培养12h,收获该细胞,流式细胞仪检测CTLA-4及Foxp3的表达情况,同时留取细胞培养上清,ELIsA法测定上清IL-10的变化情况。结果:1.小鼠CD4~+CD25~+Treg纯度分析:多次分选细胞实验证实,正常小鼠脾脏单个核细胞经过MACS两次分选后,CD4~+CD25~+Treg纯度可达(此处忽略..)到91%以上。所获得的CD4~+CD25~+Treg经台盼蓝检测活性大于97%。2.HMGB1刺激可诱导CD4~+CD25~+TregTLR4表达水平明显下调(P<0.05或P<0.01),其中,在剂量-效应关系的实验中(HMGB1刺激时间为48小时),100ng/ml和1000ng/ml组TLR4分子表达水平的下调程度显著大于10ng/ml组(P<0.05或P<0.01),而100ng/ml组与1000ng/ml组之间TLR4表达水平没有统计学差异(P>0.05);在时间-效应关系的实验中(HMGB1刺激浓度为100ng/ml),观察到24h、48h和72h时间点TLR4分子的表达水平均呈现显著下降趋势,但各时间点的表达水平无明显差异(P>0.05)。3.HMGB1(100ng/ml)刺激CD4~+CD25~+Treg,CTLA-4和Foxp3在24h、48h和72h表达水平较正常对照组均显著下降(P<0.01),以48h和72h组下降尤为明显;不同剂量HMGB1刺激CD4~+CD25~+Treg48h其CTLA-4和Foxp3表达水平亦显著下调(P<0.01),其中以100ng/ml和1000ng/ml组降低幅度尤为明显。经封闭TLR4预处理后,给予HMGB1(100ng/ml)刺激24h、48h和72hCD4~+CD25~+Treg表达CTLA-4和Foxp3的水平均较对正常照组显著增强(P<0.05或P<0.01);而不同剂量HMGB1刺激CD4~+CD25~+T(本文此处忽略..)reg48h,仅以100ng/ml组能显著上调CTLA-4和Foxp3的表达水平(P<0.01)。4.体内实验中,两种小鼠Treg细胞表达CTLA-4和Foxp3的基础水平没有明显差异(P>0.05);而腹腔注射HMGB1后,两种小鼠CD4~+CD25~+TregCTLA-4和Foxp3的表达水平存在显著性差异,其中C3H/HeN小鼠CD4~+CD25~+Treg表达CTLA-4和Foxp3水平较对照组水平显降低,以20μg剂量刺激时降低的最明显(P<0.01);C3H/HeJ小鼠CD4~+CD25~+TregCTLA-4和Foxp3的表达水平较对照组水平显著上调(P<0.01),以10μg刺激时表达水平上调的最为明显(P<0.01)。结论:1.免疫磁珠法分离所得的CD4~+CD25~+Treg细胞纯度高,细胞活力未受明显影响,完全可以满足进一步实验的要求。2.HMGB1刺激CD4~+CD25~+Treg可下调TLR4的表达水平,提示TLR4可能参与调节CD4~+CD25~+Treg免疫活性的过程。3.通过对TLR4进行抗体封闭处理前后CD4~+CD25~+Treg免疫活性变化情况的比较发现,TLR4在HMGB1介导CD4~+CD25~+Treg免疫反应过程中具有负向调控CD4~+CD25~+Treg免疫活性的作用。4.HMGB1刺激可引(文章此处忽略..)起TLR4野生型和突变型小鼠的CD4~+CD25~+Treg发生截然不同的免疫活性改变,进一步揭示和明确了在HMGB1刺激过程中,TLR4是负向调控CD4~+CD25~+Treg免疫活性的重要受体之一。


以上为本篇毕业论文范文高迁移率族蛋白B1影响小鼠调节性T细胞免疫功能的受体机制研究的介绍部分。
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