人低氧诱导因子1α-Ala402-Ala564双突变型腺病毒载体的构建及鉴定

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人低氧诱导因子1α-Ala402-Ala564双突变型腺病毒载体的构建及鉴定

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毕业论文范文题目：人低氧诱导因子1α-Ala402-Ala564双突变型腺病毒载体的构建及鉴定，论文范文关键词：人低氧诱导因子1α-Ala402-Ala564双突变型腺病毒载体的构建及鉴定
人低氧诱导因子1α-Ala402-Ala564双突变型腺病毒载体的构建及鉴定毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：背景缺血性心脏病目前常规治疗有药物治疗、冠脉介入(PCI)及冠脉旁路移植术(CABG)等，然而相当一部分患者药物治疗难以见效，也不适于常规血管再通术处理，另外还有些患者经过上述处理后仍然存在冠脉再狭窄、心肌微小血管功能障碍、心功能低下，因此必须寻求其它治疗方法。近年来，随着分子生物学技术的巨大进步，基因治疗促缺血心肌血管新生已成为冠脉血运重建术中具有发展前景的新方向。在血管新生的过程中，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)及其受体、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)等参与了血管内皮细胞的分化增殖、血管形成及成熟。目前促血管生长因子研究较多的有VEGF、FGF等，虽然Ⅰ期临床试验结果证明安全有效，但Ⅱ期临床试验结果并不理想。确凿的资料显示VEGF可导致新生血管不成熟、组织水肿、血管渗漏等，而FGF治疗则与蛋白尿等有关。血管生长过程本身受一系列生长因子的调节，且这些生长因子（略..）必须相互协调、相互补充，单个生长因子治疗并不足以诱导成熟的血管新生，因此人们在探索基因治疗时，力求找到能促进多基因表达的因子，以诱导生理功能完整的血管新生。低氧诱导因子-1(hypoxiainduciblefactor1，HIF-1)是细胞对低氧／缺氧作出适应性反应的关键性转录因子，在缺氧条件下可稳定表达，它可通过对VEGF等60多种靶基因的转录调控而促进这些基因表达，参与了血管新生、红细胞生成、糖代谢等病理生理过程。临床前期研究表明，应用具有组成型表达活性的HIF-1α基因治疗可诱导生理功能完整的新生血管。HIF-1α诱导的新生血管具有无明显炎症反应、不渗漏、不引起组织水肿的特点，此外，HIF-1α还可以促进EPO、HO-1、INOS等基因的转录，具有抗细胞凋亡、改善心肌细胞代谢等血管新生以外的作用。因此，人们对HIF-1α的促血管新生治疗寄予厚望。HIF-1具有α、β两个亚单位，HIF-1α是HIF-1的调节亚基和活性亚基，受低氧诱导，决定HIF-1的活性。但HIF-1α常氧下（此处忽略..）容易降解，主要与常氧状态下HIF-1α氧依赖降解区(oxygendependentdegradationdomain，ODDD)Pro402和Pro564发生羟基化有关，突变其中任一位点的单突变型HIF-1α在常氧下都可以得到表达，而双突变型HIF-1α则近乎是一种组成型表达，即其常氧状态下的蛋白表达水平与野生型HIF-1α在低氧状态下的表达差不多。腺病毒载体较其他病毒载体具有制备容易、感染谱广、病毒滴度高、表达时间短(1-2周)，不引起插入突变等优点而成为治疗性血管新生最具临床应用价值的载体之一。为此我们在已定点突变其Pro564为丙氨酸(Ala564)基础上，构建重组人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564(双突变型)，以进一步研究常氧条件下该突变型基因表达及对冠心病的血管新生作用，为冠心病的突变型HIF-1α基因治疗研究奠定基础。目的构建能在哺乳动物细胞得到外源基因高表达的携带HIF-1α-Ala402-Ala564基因的重组腺病毒载体，为HIF-1α基因及其突变型对缺血性心脏病（文章此处忽略..）的血管新生作用及以后的临床应用奠定基础。方法采用分子克隆技术，在业已完成的pShuttle2-HIF-1α-Ala564的基础上，用连续聚合酶链式反应(PCR)定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA，构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564，以PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切重组穿梭质粒，获得含有突变型HIF-1αcDNA的表达盒，通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-XViralDNA连接，重组成pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒质粒，经酶切及测序鉴定正确后，在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒，并进行PCR鉴定及滴度测定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组穿梭质粒及重组腺病毒质粒构建成功，pShuttle2-HIF-1α-Ala564及pAdeno-HIF-1α-Ala564质粒中HIF1αcDNA402位均为脯氨酸(Pro)密码子CCA，而突变型pShuttle2-HI（文章此处忽略..）F-1α-Ala402-Ala564及pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564质粒402位则为丙氨酸(Ala)密码子GCA。对照质粒pAdeno-lacZ转染HEK293细胞X-gal染色显示转染效率约20％。包装后反复冻融细胞3次得到含重组病毒的病毒液，扩增病毒后提取病毒DNA行PCR检测重组腺病毒均得到预期的287bp扩增产物，终点稀释实验法检测重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564的滴度分别为2.0×10~8pfu／ml。结论成功构建重组腺病毒双突变型的Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564，为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定了基础。

以上为本篇毕业论文范文人低氧诱导因子1α-Ala402-Ala564双突变型腺病毒载体的构建及鉴定的介绍部分。

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