重组酶删除载体的构建及其在动物细胞中的应用

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重组酶删除载体的构建及其在动物细胞中的应用

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毕业论文范文题目：重组酶删除载体的构建及其在动物细胞中的应用，论文范文关键词：重组酶删除载体的构建及其在动物细胞中的应用
重组酶删除载体的构建及其在动物细胞中的应用毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：随着转基因技术的发展和应用,尽管这项技术有着巨大的潜在效益,但人们也逐渐认识到其可能带来的负面效应。克隆动物及器官移植作为人类延续生命的重要技术而受到广泛关注,同时又与转基因动物安全性密切相关。因猪及其肾脏在生理学上与人体器官存在的类似性,所以能够作为一种重要的动物模型,成为目前研究最多的供体动物和供体器官。在获得克隆产物后,外源基因尤其是选择标记基因的去留问题成（略..）为了人们关注的交点。为了最大限度地降低选择标记基因带来的潜在风险,就需要对外源基因进行选择性的删除。本实验利用位点专一性重组系统,尝试构建含有重组酶识别位点的质粒,并以猪肾上皮细胞为研究材料,进行删除实验并验证其删除效果。主要研究结果包括:(1)根据试验需要,设计中间为多克隆位点、两侧为双重组酶识别为点(CreFLP)的序列,并首次利用重叠延伸PCR技术得到全长211bp的目的片（此处忽略..）段,克隆目的片段到pMD18-TSimple骨架载体上:(2)分别以pcDNA3.1、pEGFP-N3、pIRES质粒为模板,扩增选择标记基因:新霉素抗性基因(neomycin)、增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP),强启动子基因(CMV)和内部核糖体进入位点(IRES)序列;(3)将获得的两个选择标记基因(Neomycin和EGFP)以分别单独启动子表达的形式和IRES介入的同时表达的形式连接到含有目的片（本文此处忽略..）段的骨架载体上;(4)以(3)中获得的两个载体为骨架,替换掉Cre重组酶识别位点,得到另外两个只含有FLP重组酶识别位点的载体,成功共得到不同识别位点和不同蛋白表达方式的四种目的载体;(5)首次尝试以猪肾上皮细胞(PK15)为材料,转染上述四种质粒,G418筛选获得了稳定表达的单克隆细胞系,证明了构建的载体成功的表达了选择标记基因;(6)二次转染FLP重组酶质粒,传代3次后提取转染后细胞的RNA和对照组（本文此处忽略..）RNA,通过RT-PCR反应得到cDNA模板;(7)应用相对定量PCR反应验证选择标记基因删除前后在表达量上的变化,结果差异显(P＜0.05)。(8)流式细胞仪检测pCF质粒、pCF-pA质粒、pF质粒、pF-pA质粒删除效率分别为:21%、25%、18%、16%。

以上为本篇毕业论文范文重组酶删除载体的构建及其在动物细胞中的应用的介绍部分。

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