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贝类中诺如病毒检测方法的建立与优化

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毕业论文范文题目：贝类中诺如病毒检测方法的建立与优化，论文范文关键词：贝类中诺如病毒检测方法的建立与优化
贝类中诺如病毒检测方法的建立与优化毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：诺如病毒(Noroviruses,NVs)是非细菌性肠胃炎的主要病原体,通过食品和水源传播可以引起全球范围的流行。流行病学调查提示双壳软体动物是NVs最主要的传播载体。近年来,由于生食含有NVs的贝类等水产品引发的世界范围的大规模肠胃炎疫情不断暴发,给消费者健康造成了巨大威胁,也给水产行业带来了重大损失。我国是贝类养殖大国,系统研究NVs的检测技术,建立贝类水产品中NVs快速灵敏的定性、定量检测方法,开展水产品中NVs污染状况流行病学调查,对于提供NVs检测技术,预防疫情暴发、减少渔业经济损失具有重要现实意义。NVs目前尚不能体外培养,变异多,鉴别和检测非常困难,传统的免疫学及血清学检测方法存在（本文此处忽略..）很大的局限性。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)已经成为定性检测NVs的黄金法则,实时荧光定量RT-PCR(Real-timeRT-PCR)、实时序列特异性核酸体外扩增(Real-timeNASBA)等定量分子检测技术在病毒载量检测中已显示出越来越多的优势。根据诺如病毒RNA聚合酶区保守序列,优化了4对NVs引物的反应体系,筛选了最适合于贝类样品检测的引物为JV13I/JV12Y。并且以此引物作为定性检测方法,采用正交方法设计了9个实验组,充分考虑pH值、吸附剂和沉淀剂之间的交互关系,通过人工污染实验,筛选出了一种富集浓缩贝类中NVs最优方法,即在吸附缓冲液中性环境(pH7.5)下,以苏氨酸作为吸附剂吸附两次,9%PEG6000和（本文此处忽略..）7%的PEG8000各沉淀一次,此法病毒回收率可达23%。以SYBRGreenI为染料,以携带NVs基因片段的高纯质粒DNA作为标准质粒,通过改变信号收集温度,去除了大部分非特异性扩增的干扰,建立了检测贝类中NVs的实时荧光定量RT-PCR方法。当标准质粒量在108-103拷贝之间具有良好的线性关系,可以检测到10-5稀释度的病毒RNA,是常规RT-PCR法的100倍,方法操作简便,可以有效的节约时间、降低成本,取得较好的定量效果。使用TaqMan探针法,通过SP6酶体外转录成cRNA作为荧光定量的标准品,建立了一步法TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,简化了操作步骤,消除了样本处理与RT效率的不同对结果准确性造成的差异,能够最（文章此处忽略..）大限度提高贝类中NVs定量的可靠性,当cRNA标准品为108-102拷贝之间具有良好的线性关系,可以检测到10-6稀释度的病毒RNA,方法速度快,特异性好,为NVs快速准确定量提供了技术支持。自行设计了用于实时NASBA扩增反应的引物和分子信标,初步建立了基于LightCycler2.0荧光定量仪的NVs实时NASBA检测方法,特异性好,灵敏度高于实时荧光定量RT-PCR方法,在cRNA标准品为108-100拷贝间标准曲线具有良好的线性关系。据我们所知,使用RocheLightCycler2.0荧光定量仪进行NVs实时NASBA扩增的研究尚属首次。本研究表明,实验室可以使用RocheLightCycler2.0实时定量仪可以代替特殊（略..）的扩增仪器成功的进行实时NASBA扩增。运用研究中建立的定性和定量检测方法,对2007年9月到2008年8月在山东半岛8个地区采集的186份贝类样品进行检测,从分子水平上初步分析了山东半岛地区贝类中NVs的污染状况和基因型别,结果有5份贝类检出NVs,冬季为高发季节,GGII-4型为贝类中NVs的主要类型,在一定程度上反映了我国沿海地区贝类中NVs污染状况,补充了我国水产品NVs污染状况数据,为开展全国性的NVs的风险评估和分子流行病学调查打下了基础。

以上为本篇毕业论文范文贝类中诺如病毒检测方法的建立与优化的介绍部分。

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