泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究

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泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究

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毕业论文范文题目：泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究，论文范文关键词：泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究
泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目的：泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin-proteasomepathway）通过泛素与靶蛋白赖氨酸残基的结合来参与调控生物体内多种重要进程，包括细胞膜转运，组蛋白修饰，转录调控，DNA的修复及复制等。溶酶体系统和泛素蛋白酶体通路共同构成细胞内蛋白质降解的主要途径。与蛋白质磷酸化和去磷酸化一样，泛素化和去泛素化是一个被严格调控的可逆过程，其中去泛素化酶（DUB）是调控中的一个重要环节。泛素特异性蛋白酶（USPs）是去泛素化酶成员中最多的一类，它通过去除靶蛋白上的泛素分子来对蛋白质的泛素化进行负向调节。研究发现多种去泛素化酶与神经系统病变等众多疾病的发生有密切的关系。USP46是本课题组克隆成功的泛素特异性蛋白酶，位于4q12，编码366个氨基酸。最近研究发现，泛素特异性蛋白酶USP46在悬尾试验（TailSuspensionTest，TST）和强迫游泳试验（ForcedSwimmingTest，FST）中是调节小鼠不动行为的数量性状基因。usp46第92号赖氨酸的缺失后小鼠的不动时间明显缩短，因此他们提出去泛素化酶USP46与小鼠的行为抑郁有关。而我们课题组在克隆出usp46的同时也证明了当usp46的第92号赖氨酸缺失后，其去泛素酶活性降低为野生型的27.04%。本课题通过构建USP46错义突变A81V、T187P的表达质粒和去泛素化酶活性检测体系，分析A81V、T187P对酶活性的影响。同时，通过建立USP46错义突变的基因分型方法，在中国汉族人群和儿童注意缺陷多动障碍(AttentionDeficit/Hyperactivit（本文此处忽略..）yDisorder,ADHD)患者中对USP46A81V、T187P突变进行初步筛查，为进一步的分子流行性学研究奠定基础。方法：（1）以课题组前期克隆成功的质粒pACT7-usp46-WT、pGEX-usp46-WT为模板，采用定点突变法构建usp46突变型质粒pACT7-usp46-T187P，pGEX-usp46-T187P，pGEX-usp46-A81V，pGEX-usp46-C44S，并测序验证，为突变型USP46的活性分析做准备（usp46突变型C44S为44号半胱氨酸定向突变为丝氨酸；A81V为81号丙氨酸定向突变为缬氨酸；T187P为187号苏氨酸定向突变为脯氨酸）。（2）采用T7-USP/GST-Ub52去泛素化酶活性检测体系，以GST-Ub52为模型底物检测USP46C44S、A81V、T187P突变型的去泛素化酶活性。USP46的表达质粒分别与pGEX-Ub52共表达。去泛素化酶UBP2为阳性对照。经GSH-Sepharose-TMResin纯化蛋白系统纯化GST融合蛋白，进行10%SDS-PAGE电泳检测。以野生型USP46的活性为标准（即切断产物的36kDa蛋白条带亮度与45kDa底物蛋白条带亮度的比值），采用Odyssey双色红外激光成像系统分析野生型和突变型的活性差异。用兔抗T7多克隆抗体检测融合蛋白T7-USP的表达情况。（3）采用GST-USP/Ub-Met-β-gal去泛素化酶活性检测体系，以Ub-Met-β-gal为模型底物检测USP46C44S、A81V、T187P突变型的去泛素化酶活性。可表达GST的USP表达质粒与pAC-ub-β-gal模型底物质粒共转化BL21感受态细胞，研究去泛素化酶野生型及突变（略..）型将模型底物Ub-Met-β-gal融合蛋白去泛素化的能力，从而分析USP46野生型与突变型的去泛素化活性。去泛素化酶UBP2作为阳性对照。用小鼠抗β-gal单克隆抗体检测底物Ub-Met-β-gal的表达情况，用兔抗GST多克隆抗体检测融合蛋白GST-USP的表达情况。以野生型USP46的活性为标准（即切断产物Met-β-gal蛋白条带亮度与Ub-Met-β-gal底物蛋白条带亮度的比值），采用Odyssey双色红外激光成像系统分析野生型及突变型活性差异。（4）收集健康人群及ADHD患病儿童的血液样本。（5）建立去泛素化酶usp46错义突变基因检测方法。提取血液样本中的基因组DNA。分别设计扩增A81V、T187P位点的特异性引物，确定扩增特异性DNA片段的PCR反应参数。（6）将特异扩增的usp46A81V、T187P目的片段进行测序分型。（7）利用DNAStar和Chromas软件对结果进行分析。结果：（1）构建出usp46突变质粒pACT7-usp46-T187P、pGEX-usp46-T187P、pGEX-usp46-A81V、pGEX-usp46-C44S。酶切鉴定及测序验证均正确。（2）以GST-Ub52为模型底物构建去泛素化酶活性检测体系分析USP46野生型与突变型去泛素化酶活性。模型底物GST-Ub52大小约为42kDa，与预期大小一致。USP46野生型和A81V突变型成功将GST-Ub52切断，产生大小约为36kDa的产物，而突变型A81V切断底物的能力下降表明去泛素化酶活性降低。突变型C44S、T187P表达后未能切断模型底物说明不具有去泛素化酶活性。以野生型USP46的（此处忽略..）活性为标准，突变型A81V的活性降低42.91%±1.42%（mean±SD；n=3，P=0.000）。（3）以Ub-Met-β-gal为模型底物构建去泛素化酶活性检测体系研究USP46的各突变类型去除泛素分子的能力。阴性对照可见两条带：上侧为模型底物Ub-Met-β-gal，下侧为内源性β-gal蛋白。阳性对照可见三条带，在Ub-Met-β-gal与内源性β-gal条带之间还可见另一条带，即Ub-Met-β-gal被去泛素化酶去除泛素后的产物Met-β-gal；USP46野生型、突变型A81V与阳性对照一致，而突变型A81V切断底物能力下降表明去泛素化酶活性降低；突变型C44S、T187P表达后未能切断模型底物说明其已失去去泛素化酶活性。以野生型USP46的活性为标准，突变型A81V的活性降低28.5%±5.96%（mean±SD；n=3，P=0.002）。（4）研究对象的基本特征：共纳入健康献血员122人。ADHD病例组87人，年龄为5岁-14岁，平均年龄8岁±1.85岁（mean±SD）。其中男孩42例，占总人数的48.28%；女孩45例，占总人数的51.72%。（5）基因组DNA提取：采用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA试剂盒从所收集到的血液标本（抗凝全血）中提取基因组DNA。所提取的DNA产物浓度为52.9ng/μl-227.2ng/μl，OD260/OD280的比值为1.55-2.17，可认为DNA的纯度较好。上样量1μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见单一条带，说明基因组DNA完整性好。（6）建立去泛素化酶usp46错义突变基因检测方法。扩增出221bp的A81V位点目的片段及347bp的T187P位点目的片段。（7）PCR产物测序结果：使用DNAS（此处忽略..）tar将PCR产物测序所得序列与数据库中参考序列比对，122例健康对照组与87例病例组均与参考序列一致；测序峰图显示在所预期的碱基突变位点处均未发现突变。结论：（1）构建了USP46A81V和USP46T187P突变体表达质粒。（2）以GST-Ub52和Ub-Met-β-gal为模型底物检测USP46错义突变对酶活性的影响，发现T187P突变导致USP46的去泛素化酶活性完全丧失，而A81V突变导致USP46酶活性降低为野生型的28.5%-42.91%。（3）建立了去泛素化酶USP46A81V、T187P突变的基因分型检测方法。（4）初步筛查未发现健康献血员和ADHD患者中USP46A81V、T187P两个位点出现变异。

以上为本篇毕业论文范文泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究的介绍部分。

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