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A型肉毒毒素轻链表达及其生物活性检测

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毕业论文范文题目：A型肉毒毒素轻链表达及其生物活性检测，论文范文关键词：A型肉毒毒素轻链表达及其生物活性检测
A型肉毒毒素轻链表达及其生物活性检测毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：肉毒神经毒素(Botulinumneurotoxin,BoNT)是由厌氧的肉毒梭状芽孢杆菌产生的一种烈性蛋白毒素。肉毒毒素是目前已知毒性最强的蛋白毒素,被列入6种顶级生物恐怖剂之一,在民间误食肉毒毒素造成食物中毒的事件也时有发生,近年来肉毒毒素还被广泛用于美容及肌肉痉挛、腺体分泌过多等疾病的临床治疗。无论对于样品的侦检和产品的质控都亟需一套快速简便的方法,建立肉毒毒素快速、灵敏、可靠的生物活性检测方法对于生物反恐和医学检测都具有重要意义。肉毒毒素有7种血清型(A—G),各种毒素均由一条重链和一条轻链通过二硫键连接而成。重链N端能够结合特定胆碱能神经末梢质膜受体,C端主要在内化过程中起作用。而轻链是毒素的毒性成分,在重链的辅助下进入细胞,轻链能够穿过膜囊泡并且裂解胞质内的特定蛋白SNARE蛋白(可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性因子结合受体蛋白),阻断神经递质释放,导致肌肉松弛型瘫痪。其中,A型、E型和C1型的底物是突触小体相关蛋白SNAP25。目前,肉毒毒素检测的标准方法是小鼠急毒实（文章此处忽略..）验,但此方法周期长,步骤繁琐,需牺牲大量动物,数据波动大。因此,研究者一直在积极寻找一种可替代的方法。早期的检测方法主要基于毒素的抗原性,但这种方法仅能检测毒素的生物量,不能反映毒素的生物活性。近年来出现了一些基于轻链蛋白酶活性的检测方法。其中一类是荧光检测,另一类是检测底物的内部抗原。本课题旨在建立后一类基于底物内部抗原检测A型肉毒毒素生物活性的分析方法,其基本原理是利用A型肉毒毒素轻链蛋白能裂解底物SNAP251-206的Q197-R198特异位点,裂解后形成SNAP251-197(我们称为SNS蛋白),裂解后原先包埋于C端α螺旋内部的一个8肽抗原表位(SNAP25190-197)被暴露出来,通过检测此8肽的抗原性,可进行毒素蛋白酶活性的定性、定量测定。肉毒毒素毒性极强且来源受限,在实际操作中存在一定危险,而单独轻链和重链则不具毒性,我们尝试利用表达的A型肉毒毒素轻链进行内肽酶生物活性检测方法的建立。根据大肠杆菌密码子的偏好性,对A型肉毒毒素轻链全基因序列进行了优化和人工合成,并克隆至pTIG-Trx共表达质粒,实现了A（略..）型肉毒毒素轻链蛋白与硫氧化蛋白的高效共表达,其表达形式大部分为可溶蛋白,可溶蛋白占全菌蛋白的36.8%,表达量达294.4mg/L。经纯化后蛋白纯度达99%以上,经SDS-PAGE及Western-blot鉴定对底物SNAP25蛋白具有良好的降解活性。毒素轻链的高效可溶表达目前在国内外还未见报道。利用RT-PCR的方法从小鼠脑组织中扩增得到A型肉毒毒素的底物突触小体相关蛋白SNAP25的基因,克隆至pTIG-Trx共表达质粒,实现了SNAP25蛋白与硫氧化蛋白的共表达,表达产物均为可溶蛋白,占全菌蛋白的26.2%,表达量达115.4mg/L,经纯化后蛋白纯度达95%以上。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,SNAP25蛋白可被A型肉毒毒素轻链蛋白降解。采用pET28a表达质粒,克隆、表达并纯化了SNAP25的裂解产物SNS蛋白,其表达形式全部为可溶蛋白,表达蛋白占全菌蛋白的20.3%,表达量为203mg/L,亲和纯化后纯度大于95%。经ELISA鉴定其具有良好的反应原性,冻干长期保存稳定性良好,可作为抗原参照蛋白进行BoNT/A（略..）体外生物活性的定量分析。合成了SNAP25190-1978肽序列,将其交联至KLH(钥孔戚血蓝蛋白)上,于新西兰大耳白兔体内制备了其抗体,并经蛋白A亲和层析柱从抗血清中纯化获得了总IgG。经鉴定,此抗体检测灵敏度大于125ng/mL,具有良好的灵敏度,符合检测抗体的条件。利用A型肉毒毒素轻链蛋白于体外建立了基于BoNT/A内肽酶活性的ELISA检测方法,并对该检测方法的条件进行了优化。底物最佳包被浓度确定为3μg/mL,检测样品反应时间为90min,A型肉毒毒素轻链蛋白检测限为12fg/mL,有效检测范围为0.023—24.0pg/mL,检测方法的3组组内精密度CV均值分别为5.2%、5.4%、3.9%,组间精密度CV均值为6.3%,方法回收率介于92.6%—111.5%之间,考察了样品中可能存在的干扰物质(牛奶、血清、甘油等)对测定结果的影响,分析结果证明所考察的物质对测定结果均无显著影响,表明该方法快速、灵敏、稳定、可靠,可用于实际样品的检测。以BoNT/A轻链蛋白及SNS蛋白作为参照蛋白进行定量检测,考察了2种蛋白与BoNT/ALD50间的量效关系。通过软件对（略..）分析数据进行拟合可以得到检测响应值与剂量的函数关系。分析结果显示,1LD50/mLBoNT/A相当于35.0pmol的BoNT/A轻链蛋白或38.9nmol的SNS。A型肉毒毒素检测限可达0.004LD50/mL,最佳检测范围为0.15—2.41LD50/mL,方法回收率介于91.6%—112.9%之间,杂质加样回收率介于84.9%—135.4%之间。本文成功实现了A型肉毒毒素轻链的表达,并建立了一种A型肉毒毒素生物活性灵敏可靠的检测方法,该方法比目前已知的动物实验方法还要高出1-2个数量级,可满足A型肉毒毒素样品的定量检测需求,其检测原理还可望进一步推广至其他血清型肉毒毒素的检测。

以上为本篇毕业论文范文A型肉毒毒素轻链表达及其生物活性检测的介绍部分。

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