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黄连及其制剂中生物碱类化合物的HPLC测定方法概述
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黄连及其制剂中生物碱类化合物的HPLC测定方法概述
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黄连及其制剂中生物碱类化合物的HPLC测定方法概述
黄连及其制剂中生物碱类化合物的HPLC测定方法概述毕业论文范文介绍开始:
目录
一、HPLC测定原理与特点
2
(一)、HPLC测定原理
2
(二)、HPLC特点
2
二、黄莲主要化学成分及其药理作用
2
(一)、黄莲中主要化学成分
2
(三)、黄莲药理作用
2
三、黄连及其制剂中生物碱类化合物的HPLC测定方法概述
2
(一)、HPLC法同时测定黄连中 5 种生物碱[ 1 ]
2
(二) 、复方黄连素片中盐酸小檗碱的溶出度[2]
5
(三) 、高效液相色谱法测定黄连上清胶囊中连翘苷含量[3]
7
三、 总结
9
七、参考文献
9
一、HPLC测定原理与特点
HPLC法(高效液相色谱法)基于仪器方法的高效能的分离方法。在药品含量测定上的应用已经非常普遍。现常用于药物分析过程、中药物或者中药制剂的各主要成分、杂质进行分离检测。
(一)、HPLC测定原理
通过两种完全不相溶的液相,也就是使固定相与流动相按照它们各自的溶解度进行分配。分配色谱法又分为液-液色谱与键合相色谱。液-液色谱通过物理吸附的原理把液相固定相涂抹于所测物品表面。而键合相色谱则是根据化学反应使有机分子键合在所测物品或者是硅胶表面上。在分配色谱中,需要依据溶质、固定相和流动相之间分子的分离作用力对流动相和固定相进行选择。
(二)、HPLC特点
首先是检测器基本上都是选择性高、灵敏度高、检出率高检测时间较短,分离效果较好;其次是操作上是快速、高效、样品回收利用比较简单。因此,可以高效率、有效与准确的测定药品含量。
二、黄莲主要化学成分及其药理作用
(一)、黄莲中主要化学成分
黄连来源于毛茛科植物黄连的根茎。其主要化学成分为黄连碱、小檗碱、药根碱、巴马汀、掌叶防己碱、木兰碱等。
(三)、黄莲药理作用
黄连由于含有众多生碱,因此,具有广谱抗菌、心脑血管系统治疗、降血糖、抗炎、抗肿瘤等作用。现代药理学研究证明:如小檗碱不仅具有抗菌消炎、抗肠道细菌感染等作用,还有抗心律失常、扩张冠状血管、调血脂、降血糖、抗肿瘤、抗血小板聚集、抗消化性溃疡,促进胆汁分泌、兴奋大脑皮层、松弛血管平滑肌,兴奋子宫、膀胱、支气管、胃肠道平滑肌等作用。药根碱具有抗心律失常和抑菌作用。
三、黄连及其制剂中生物碱类化合物的HPLC测定方法概述
(一)、HPLC法同时测定黄连中 5 种生物碱[ 1 ]
本实验应用四种离子液体流动相添加剂的HPLC法同时测定黄连中5 种生物碱。
1、黄连简介
黄连临床应用上有治疗疾病在作用,是其生物碱产生的。主要有效成分如药根碱、表 小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱。由于其主要生物碱易与固定相表面残留硅醇基相互作用而引起严 重的峰拖尾和峰展宽。应用 1-烷基-3-甲基咪唑类离 子液体作为流动相添加剂,同时测定黄连中药根 碱、表小檗碱、黄连碱、小檗碱和巴马汀含量。
2、实验步骤
①仪器与试剂
仪器:Agilent1100 高效液相色谱仪( 德国安捷伦)、SK3300LH 超声波清洗器(上海科导超声仪器)、UB-7 型 pH 计(北京 Denver ) 。
试剂:盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马 汀和盐酸小檗碱( 中国药品生物制品检定所),1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼 酸 盐 ( pH 5.13) 、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼 酸盐( pH 4.82) 、1-己基-3-甲 基 咪 唑 四 氟 硼 酸 盐( pH 4.18)、1-己 基-3-甲基咪唑氯 盐 ( pH 7.19)、 甲醇( 色谱纯)、实验用水为纯净水,试剂均为分析纯。
样品:黄连,物粉碎机粉碎,粒径约为0.38 mm。
②色谱分析条件
色谱柱为 SPHER IGEL ODS C18 (250mm×4.6mm,I.D.5 #m) ,流动相为含有 25 mmol /L[HMIM][BF4],pH3.0的甲醇: 水溶液(25:75,V/V),动相流速为 1.0 ml /min,检测波长为 345 nm,进样量为20 μl,柱温为室温。
③标准溶液与样品溶液配制
标准溶液配制:称取适量盐酸药根碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、 盐酸巴马汀和盐酸小檗碱,分别溶于甲醇中,得到质量浓度为 1. 0 g /L 的标准储备液。
标准工作液: 移取适量的标准储备液于 5 ml 容量瓶中,加甲醇稀释至刻度。
样品溶液配制:称取0.20 g的0.38mm黄连粉末,加入50 ml的甲醇溶液超声 30 min,将超声后的溶液以 4000 r/min 的转速离心 15 min,将上清液转移到50 ml的容量瓶中,用甲醇溶液定容,最后经 0.45 μm微孔滤膜过滤。
3、结果
考查了3种具有不同烷基链长度的离子液体 ([EMIM ][BF4 ],[BMIM ] [BF4 ]和[HMIM][BF4)和另一种具有相同烷基链长度阴 离子不同的离子液体([HMIM][Cl)作为流动相 的添加剂,对黄连中5种生物碱的HPLC分离的影 响,色谱图见图 1,5种生物碱的保留因子、分离度 及理论塔板数等数据见表1。由图1和表1可以看出,当离子液体作为流动相添加剂时,分析物的保留时间、分离效率、分离度以及色谱峰的对称性 都得到了显著的改善。
4、结论
本实验采用四种离子液体作为HPLC流动相添加剂,优化了测定黄连中药根碱、表小檗碱、黄连 碱、巴马汀和小檗碱的条件,对黄连中的药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱进行了分离测定。
(二)、复方黄连素片中盐酸小檗碱的溶出度[2]
采用转篮法测定复方黄连素片中盐酸小檗碱的溶出度,以高效液相色谱法定量。
1、制剂简介
复方黄连素片。主要成分:由盐酸小檗碱、木香、吴茱萸、白芍。本品为糖衣片。临床应用:清热解毒、抗肠道细菌感染。
2、实验步骤
①仪器与试剂
仪器:岛津 LC- 10AT 高效液相色谱仪;N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);RCZ- 8 A 型智能药物溶出仪(天津大学精密仪器厂)。
试剂:乙腈(色谱纯,美国 TEDIA 公司);磷酸二氢钾(分析纯,国药集团化学试剂);盐酸小檗碱对照品(110713- 200911,中国食品药品检定研究所);
样品:复方黄连素片(自制,3个批次:批 号 为 20150501、20150502、20150503)。
②色谱分析条件
色谱柱:RP- C18 柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相:0.033 mol 磷酸二氢钾(取磷酸二氢钾 4.490 9 g,加水溶解至 1 000 ml)- 乙腈(600:400);检测波长:265 nm;进样量:10 μl;流速:1.0 ml/min;理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于 3 000;盐酸小檗碱与有关物质的分离度符合 R> 1.5。溶出度以 1000 ml水为溶剂,转速 100 r/min;取样时间45 min。
③溶液与溶出样品制备
溶液的制备:盐酸小檗碱储备液的配制:取对照品 25 mg 于烧杯中,加沸水溶解,稍冷后加入稀盐酸,搅匀、放置至冷却。 然后转移至量瓶中,加水定
容,制备成浓度为 100 μg/ml 的药物溶液作为储备液。盐酸小檗碱对照品溶液配制:取储备液,加入流动相稀释配制对照品溶液,于冰箱(4 ℃)中保存备
用。
溶出样品的制备:取供试品 6 片,以 1000 ml水为溶剂,按《中国药典》2010 年版二部附录 XC 第一法(篮法)[3]测定。 转速 120 r/min。 经 45 min 后取溶出液 5 ml,经 0.45 μm 微孔滤膜过滤。 滤液用流动相稀释,按照上述色谱条件进行分析,计算溶出度。
④溶出度测定
取 3 批药品各 6 片,按照溶出曲线测定方法操作。经 45 min 后,取溶液 5 ml,用0.45 μm 滤膜过滤。 精密量取续滤液 1 ml,加入 2 ml流动相,配制成供试品溶液。 精密量取 10 μl供试品溶液,进行 HPLC 分析,计算溶出度。
3、结果
图2复方黄连素片中盐酸小檗碱的溶出曲线
表2复方黄连素片中盐酸小檗碱的溶出度测定结果
3批样品 45 min 溶出百分率均大于标示量的70%,溶出曲线(图2)显示三批样品溶出度均一性良好。溶出45 min 后,溶出度均大于70%。故将溶出取样点设定为45 min,限度为标示量的70%,见表 2
4、结论
高效液相色谱法同时具有分析和分离的能力,该方法简便易行、准确、重复性好,可用于复方黄连素片中盐酸小檗碱的溶出度测定,为该制剂的处方筛选和质量控制奠定基础。
(三)、高效液相色谱法测定黄连上清胶囊中连翘苷含量[3]
1、制剂简介
黄连上清胶囊。主要成分:黄连、大黄、连翘、薄荷、旋覆花、黄芩、荆芥、栀子、防风、石膏、桔梗、黄柏、蔓荆子(炒)、白芷、甘草、川芎、菊花;本品为胶囊剂,功能主治:散风止痛。用于上焦热所致的头晕脑涨、口舌生疮、咽喉红肿、耳痛耳鸣、大便干燥、小便黄赤。
2、实验步骤
①仪器与试剂
仪器:XS105DU 型 Mettler Toledo 电子天平( 梅特勒托利多仪 器公司)、e2695 型高 效 液 相色谱 仪 ( 美 国 Waters 公 司 )。
试剂:连翘苷对照品( 中国食品药品检定研究院,含量为 96.8% ,批号为 201112) 、甲醇、乙腈为色 谱纯,其余试剂均为分析纯,水为纯化水。
样品:黄连上清胶囊( 市售,批号分 别为 20150104,20150402,20151002) 。
②色谱分析条件
色谱柱: Boston C18 柱( 250 mm × 4. 6 mm,5 μm) ,流 动相: 乙腈-水-冰醋酸( 25 ∶75 ∶1) ; 检测波长: 270 nm;柱温:35 ℃ ;流速: 1.0 ml / min;进样量:10 μl。
③溶液制备
对照品溶液: 称取连翘苷对照品 7. 23 mg,精密称定,置50mL容量瓶中,加适量甲醇溶解,稀释至刻度,得每 1 ml 含 0.144 6 mg 的溶液,即得。
供试品溶液: 在室温条件下,取本品 20 粒( 约 8 g) , 置研钵中研细,精密称取样品,精密称定,置具塞锥形瓶中,再精密量取甲醇 50 ml,置锥形瓶中,称定质量,浸 渍过夜,每隔 5 ~ 10 min 超声处理样品,共 60 min,称定质量,用甲醇补足减失的质量,溶液过滤,精密吸取续滤 液 5 ml,置沸腾水浴锅上,蒸发至近干时,加 0.5 g 氧化 铝搅拌均匀,转移至中性氧化铝柱( 100 ~ 120 目,1 g,内径 1 cm) ,70% 乙醇 100 ml 洗脱,收集续滤液,至水浴蒸干,加 50% 甲醇溶解,再转移至 5 ml 容量瓶中,稀释 至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。 阴性对照品溶液: 取按样品制备工艺制备的缺连 翘阴性样品,按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。
④含量测定
线性关系考察:精密吸取对照品溶液 5,10,20,30,50μl,注入液相色谱仪,按拟订色谱条件测 定 峰 面 积 。以 对 照 品 溶 液 的 峰 面 积 ( Y ) 为 纵 坐标、进样量 ( X ) 为横坐标进行线性回归,得回归方程Y = 92076 X - 63016,r = 0.9999( n = 5) 。结果表明,连翘苷进样量在0.7230 ~ 7.230 μg 范围内与峰面积线性 关系良好。
精密度:取同一对照品溶液,连续进样5次。结 果连翘苷峰面积的RSD 为 0.27% ( n = 5) ,表明仪器精 密度良好。
重复性试验:
表3黄连上清胶囊中连翘苷加样回收试验结果( n = 6 )
加样回收试验:精密称取6份已知含量的样品( 批 号为 20150104) 约 4 g,分别加入连翘苷对照品溶液 1.5,2.0,2.5 ml,依法制备供试品溶液,进样测定,计算回收率。结果见表3。
样品含量测定:取黄连上清胶囊3批,依法检测 。结果批号为 20150104,20150402,20151002 的 3 批样品中连翘苷含 量分别为 69.68,72.31,70.75 μg / g。
3、结果
在此色谱条件下,理论板数按连翘苷峰计算可达 10000 以上。
4、结论
Boston C18 柱分离效果最好,稳定性强,基线和柱效明显优于另外几根柱子,符合连翘苷的含量测定要求。
在中药制剂分析中,大多采用反相键合相色谱法。
三、总结
黄连中含有较丰富的生物碱成分,生物碱是中草药有效成分之一,具有显著的生物活性和光学活性。 生物碱呈环状结构,可与酸形成盐,因其存在形式不同(可分为成盐型与游离型),碱性强弱也有一定差异受到中药成分复杂等因素的影响,对中药的有效成分研究还是当前的一个技术难点。HPLC 法则为解决部分中药有效成分的分析提供了新的思路,这为推动我国的中医药事业的发展也提供了支持性技术。中药制剂质量检测中,一般将具有生理活性的化学成分作为控制标准与质量评价,以衡量产品是否稳定、质量是否达标等。 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是一种具有分析速度快、检测灵敏度高、分离效率高、应用范围广、操作方便、重现性高等诸多特点的成分含量测定方法,可用于分析样品沸点、大分子量有效成分、热不稳定性等,已成为目前控制中药制剂有效成分的重要手段。
七、参考文献
[1] 严新宇,张立衡,王延翠,孙爱玲,柳仁民.离子液体作为流动相添加剂高效液相色谱法同时测定黄连中 5 种生物碱 [J].分析试验室,2017 年, 第 36 卷 第 10 期
[2] 谷 裕.高效液相色谱法测定复方黄连素片中盐酸小檗碱的溶出度 [J].山东中医药大学学报 ,2017 年, 第41卷 第 3期
[3] 周忆新,钟水生.高效液相色谱法测定黄连上清胶囊中连翘苷含量 [J].中国药业,2017 年, 第 26 卷 第 20 期
[4] 马晓彬,许立君. 高效液相色谱法在药品检验中的应用和效果 [J].海峡药学,2017 年, 第 29 卷 第 2 期
[5]贲新琰. 浅谈高效液相色谱法在药品检验中的体现 [J].科技创新与应用,2016年, 第 16期
以上为本篇毕业论文范文
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