人神经肽Y Y5受体的克隆表达及其生物信息学分析

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人神经肽Y Y5受体的克隆表达及其生物信息学分析

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毕业论文范文题目：人神经肽Y Y5受体的克隆表达及其生物信息学分析，论文范文关键词：人神经肽Y Y5受体的克隆表达及其生物信息学分析
人神经肽Y Y5受体的克隆表达及其生物信息学分析毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目前,肥胖已成为全球性的影响人类生活质量和寿命的最大威胁,是Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、高血压、中风、骨关节炎以及一些特殊类型癌症等疾病的主要诱因。据WHO统计全球有10亿成人体重超标,其中至少有3亿是肥胖患者;在我国,超重和肥胖人口也分别达到2亿和6000万。因此,肥胖已成为当前亟待解决的重大医学和社会问题。随着分子生物学和医学研究水平的提高,科学家们普遍认为神经肽Y(NeuropeptideY,NPY)与肥胖的发生发展关系密切。NPY是迄今为止发现的最强食欲增强因子,在脑尤其是室旁核中,无论是内源性还是外源性NPY都能刺激动物摄食。现已证实,NPY对进食行为的这种调节功能是在NPYY5受体(Neurope（本文此处忽略..）ptideYY5Receptor,NPY5R)的介导下完成的,多种NPY5R激动剂均可诱导进食行为,NPY5R基因的反义寡核苷酸脑室注射可特异阻断下丘脑NPY5R基因的翻译,进而减少正常大鼠与肥胖大鼠的进食次数、延长它们的进食周期并减少其进食量,最终导致减肥降脂。这暗示着NPY5R与肥胖的发生发展密切相关,并可作为一个治疗肥胖的潜在的药物靶标,而NPY5R抑制剂必将成为治疗肥胖和饮食混乱的理想药物。因此,通过分子生物学手段克隆表达纯化获得人NPY5R(hNPY5R)蛋白,并针对该蛋白构建高通量筛选模型,筛选NPY5R的抑制剂,将有助于治疗肥胖药物的开发。本研究根据GenBank公布的hNPY5R基因编码序列(G（略..）eneID:4889)设计引物,以人基因组为模板,PCR获得hNPY5R编码序列,PCR产物纯化后,经过酶切连接克隆至表达载体pESP2中,构建好的重组质粒pESP2-hNPY5R通过CaCl_2法转入宿主菌E.coliJM109中;菌落PCR、酶切及测序鉴定重组质粒;将鉴定正确的重组质粒pESP2-hNPY5R电转化粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01,然后对经菌落PCR验证后的阳性克隆诱导表达,超声波破菌后12%SDS-PAGE电泳检测,发现重组蛋白大小的条带不明显,初步推测该融合蛋白对宿主菌有较强毒性,从而导致该蛋白的表达水平低下。根据hNPY5R基因编码序列设计另外一对引物,PCR得到hNPY5R编码序列,构建重组质粒pET（略..）28a(+)-hNPY5R,转化表达菌株BL21(DE3),菌落PCR验证后对重组菌进行终浓度为0.5mM的IPTG诱导,测其OD_(600)值,绘制生长曲线;同时进行12%SDS-PAGE电泳检测,发现重组融合蛋白大小的条带不明显,由此初步认为该融合蛋白对宿主菌的生长有抑制作用,可能有较强的细胞毒性,重组菌诱导后的生长曲线的变化也证实了这一点。本论文应用VectorNT9.0、SignalP、ClustalX1.83等生物信息学软件对人NPY、NPY5R进行一级结构、功能位点、信号肽、亲/疏水性及跨膜结构等的分析;通过网上预测蛋白质二级结构的服务器PSIPRED(PositionSpecificIteratedPRED)Server(h（略..）ttp//bioinf.cs.ucl.ac.uk/prispred/)对hNPY5R蛋白进行二级结构分析和预测。通过分析和预测,发现它们都没有信号肽,都有七次跨膜结构;对hNPY5R蛋白和表达后融合hNPY5R蛋白进行二级结构分析和预测的结果显示它们结构基本一致。我们通过对hNPY5R结构及功能位点、NPY5R蛋白同源性比较和跨膜结构域的分析得到了几个高保守性位点,它们可能是hNPY5R的活性关键位点,可能与信号转导有关。

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