犬感染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫后果研究

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犬感染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫后果研究

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毕业论文范文题目：犬感染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫后果研究，论文范文关键词：犬感染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫后果研究
犬感染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫后果研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：目标犬感染性肝炎(InfectiouscaninehepatitisICH)是由犬感染性肝炎病毒(ICHV)引起的一种常见的急性败血性感染病,感染性强,无明显节令性,各种品系,不同年纪的犬均可被感染,尤其以六周龄至一岁以内的犬发病率高,逝世亡率达10～40%,对养犬业跟实验犬的豢养均可造成极大的迫害。防备本病产生的重要办法就是加强豢养管理,严格兽医卫生办法跟按期免疫接种。目前,在实验用犬跟其余养犬业,重要采取按期接种ICHV弱毒疫苗的方法。核酸疫苗是近年发展起来的一项新的免疫技巧,与传统疫苗比拟有诸多长处,被称为第三代疫苗。核酸疫苗免疫接种后,可在动物体内引诱体液免疫应答,对动物产生免疫保护作用。抗体是由抗原刺激B细胞经分化跟增殖后产生的免疫球蛋白,因此在机体接收免疫接种当前,检测机体的抗体程度,成为评估机体免疫反应及疫苗免疫后果的一个重要体液免疫指标。中跟抗体是病原微生物侵袭机体后,所产生的存在中跟相应病原微生物及其毒性产物(毒素),使病原微生物丧失感染才能或毒力的抗体,是进行病毒感染机制研究的重要工具。中跟抗体程度的监测是反应疫苗免疫原性的一个重要体液免疫指标。核酸疫苗作为一种新兴的疫苗,大量实验表明在感染性疾病、肿瘤等的防备跟医治方面存在很大的潜力。本研究室采取基因重组技巧构建了含有Loop1、Loop2的重组质粒pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠后,引诱小鼠产生针对抗原的特异性IgG抗（略..）体跟克制病毒感染的中跟抗体。为断定此核酸疫苗对犬的免疫应答后果,本研究采取pVAX1-CpG-Loop对Beagle犬进行免疫,对其体液免疫应答后果进行评估。旨在摸索pVAX1-CpG-Loop作为防备犬感染性肝炎核酸疫苗的有效性,为犬感染性肝炎病毒核酸疫苗的开发研究奠定基本。方法1质粒的提取及抗原蛋白的引诱表白跟纯化采取SDS-碱裂解法大量提取重组质粒pVAX1–CpG-Loop,采取聚乙二醇积淀法纯化质粒。并对提取的重组质粒pVAX1-CpG-Loop经分光光度计进行纯度跟浓度测定。将原核表白质粒pET28a(+)Loop转化大肠杆菌BL21(DE3),摇菌并引诱重组Loop蛋白的表白。用尿素溶解积淀,采取镍离子亲跟层析柱纯化重组蛋白,透析、复性后稀释目标蛋白。2实验动物的分组及免疫6只Beagle犬进行随机编号:1号、2号、3号犬:分辨于0、8、16周打针重组质粒pVAX1-CpG-Loop400μg、600μg、800μg/只/次,最后一次与雷同剂量的抗原蛋白共免疫;4号、5号、6号犬:分辨于0、8、16周仅打针重组质粒pVAX1-CpG-Loop400μg、600μg、800μg/只/次,每只动物均于免疫前经双侧股四头肌打针25﹪灭菌蔗糖1ml/只,15min后于雷同部位进行质粒免疫,抗原蛋白免疫于颈部皮下。7号犬:为已接种传统疫苗对比。3攻毒实验在第3次接种6周后,对实验犬进行攻毒实验。取病毒株经MDCK细胞增殖,取MDCK细胞培养物(TCID50为10-4.23/0.1ml),在麻醉状况下,（本文此处忽略..）通过口腔粘膜感染病毒,剂量为1ml/只。4免疫动物的体液免疫后果评估间接ELISA法检测免疫犬特异性IgG抗体,以包被液稀释的犬感染性肝炎病毒(1:5稀释病毒),100μl/孔包被酶联板,4℃过夜;去除包被液,以PBST洗涤3次,20﹪胎牛血清-PBST封闭,37℃于湿盒中放置1h;而后参加待检的不同稀释度的犬血清100μl/孔,37℃于湿盒中放置1h,洗涤3次;参加HRP标记的兔抗狗IgG抗体(1:2000),37℃于湿盒中放置1h,洗涤3次;参加显色底物OPD溶液100μl/孔,避光显色;参加50μl/孔2mol/LH2SO4终止反应。酶标分析仪检测492nm波长下的OD值(OD492)。以P/N大于1.8为阳性。间接免疫荧光实验(IFA)测定血清抗体效价,免疫后静脉采血,分别血清,将待测血清置56℃灭活30min,血清样品用PBS稀释为1:10、1:50、1:100、1:200、1:400、1:8006个稀释度,滴加于抗原片上,设PBS为空白阴性对比。在37℃温箱中孵育30min;PBS振荡洗涤3次,每次5min;加1:200稀释度的羊抗犬IgGFITC标记物,在37℃温箱中孵育30min;PBS振荡洗涤3次,每次5min;加1:2000稀释度的伊文思蓝,在37℃温箱中染色30min;PBS振荡洗涤3次,每次5min;最后用蒸馏水冲刷,室温吹干;用90%缓冲甘油液封片,在荧光显微镜下察看。中跟实验测定血清中跟抗体效价:收集各犬的血清,灭活后采取固定病毒-稀释血清法进行中跟实验。用DMEM将血清样品做持续倍比稀释,分辨在上述血清中参加等量的恰当滴度的病毒(100TCID50),充分混匀后置于37℃孵（文章此处忽略..）育1h;接种至敏感细胞(MDCK),100μl/孔,设两复孔,并设置畸形细胞对比;37℃,5%CO2培养箱中孵育1h;弃去血清-病毒混淆液,用Hanks液洗涤细胞3次,参加细胞保持液,37℃培养3天察看细胞病变。成果1重组质粒pVAX1-CpG-Loop的大量提取用碱裂解法大量提取所得的真核重组质粒pVAX1-CpG-Loop经分光光度计进行纯度跟浓度测定,OD260/OD280分辨为1.82、1.9、1.88。2Loop蛋白的引诱、表白跟纯化pET28aLoop重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG引诱表白,做SDS-PAGE电泳,引诱表白菌在36kDa处呈现一条蛋白表白条带,对比组无此条带。用镍离子亲跟层析柱纯化表白蛋白,SDS-PAGE电泳分析,目标蛋白纯度在95%至98%之间。3间接ELISA测定免疫犬血清IgG程度攻毒前各实验犬产生的特异性抗体无明显变更,其中1号犬及7号犬所产生的抗体效价明显高于其它犬。攻毒后各实验犬所产生的抗体效价均明显增高,7号犬在第一周达到最高值,其它实验犬在第三周达到最高值,后逐步降落持续至27周。4间接免疫荧光实验(IFA)测定免疫犬血清总IgG抗体程度攻毒前1号、4号、5号跟7号实验犬检测到IgG抗体滴度持续为1:10,其余实验犬未检测到特异性抗体。攻毒后,在第五天抗体程度开端升高,其中1号、5号跟7号犬达1:50,4号犬仍为1:10,2号、3号跟6号犬未检测到IgG抗体。从第一周开端各实验犬抗体程度开端明显升高,1号犬跟4号犬在三周达最高滴度为1:400,其它各犬在第一周达最高滴度为（文章此处忽略..）1:200。各犬抗体逐步降落持续至第7周,于第14周检测不到抗体。5中跟实验测定免疫犬血清中跟抗体程度攻毒前,除7号犬(中跟抗体效价为1:8)其余各实验犬均未检测到中跟抗体。在攻毒后,所有实验犬自第5天开端检测到中跟抗体,1号犬较其它各实验犬抗体滴度高为1:128;1号、4号、5号跟7号犬在第一周达最高滴度1:1024,其它各犬在第三周达其最高滴度,至第五周明显降落后逐步降落至第27周。论断1本室构建的犬感染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop可能诱发Beagle犬产生较好的体液免疫应答反应。2本室构建的犬感染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop可能诱发Beagle犬产生中跟抗体。

以上为本篇毕业论文范文犬感染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫后果研究的介绍部分。

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