PRRSV GP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立

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PRRSV GP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立

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PRRSV GP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种高度接触性传染病,该病可导致母猪的繁殖障碍以及仔猪严重的呼吸道疾病和高死亡率。建立快捷的诊断方法,采取相应的控制措施,是预防该病的有效手段之一。本研究以dGP5重组蛋白为包被抗原,建立一种快速简便的血清学方法。根（此处忽略..）据GenBank中已发表的PRRSVGP5全基因序列,设计合成了一对特异性引物,从六份疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的病猪肺脏中,扩增GP5蛋白完整的基因片段,将其克隆至pMD18-T载体进行测序、PCR及酶切鉴定。鉴定结果表明,GP5基因片段大小为600bp,且与其它毒株的同源性为99%。GP5蛋白在表达系统中难以表达,所以本研究去掉了氨基端疏水性较强信号肽序列。根据pMD18-T克隆载体以及pGEX-6p-1表达载体的特点,用Primer5.0软件设计另一对特异性引物,从重组载体pMD18-（本文此处忽略..）T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒pGEX-6p-dGP5,转化至E.coliBL21感受态细胞中。经1mmol/LIPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的蛋白,与预期的融合蛋白分子量基本一致,以包含体形式表达。又经Western-blotting鉴定,该蛋白与猪的PRRSV阳性血清具有良好的反应原性。可见,分子质量40ku的蛋白即为目的蛋白。将纯化的重组蛋白免疫BAL（此处忽略..）B/c小鼠,制备血清。虽然病毒中和试验显示该抗体并没有中和活性,该血清却能够与重组蛋白产生特异性反应。利用纯化的融合蛋白作为包被抗原,通过优化工作条件,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法的最适反应条件为,抗原最佳包被浓度为1.25μg/mL,封闭液为含5%犊牛血清的PBST,封闭时间是37℃封闭2h,4℃过夜。血清最佳稀释度为1∶80,待检血清37℃作用1h,酶标抗体1∶400稀释,37℃作用1h,底物显色15min终止反应。与IDEXX公司ELISA试剂盒相比,特异性为87.0%,敏感性为90.（文章此处忽略..）3%,符合率88%。而且该方法还具有价格低廉、简便、快速等优势。该方法与PEDV、CSFV、PRV、TGEV阳性血清不发生交叉反应。批内和批间重复性试验结果显示,变异系数均值都小于10%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。本研究为免疫猪群的PRRSV抗体检测及其流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

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