禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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毕业论文范文题目：禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立，论文范文关键词：禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立
禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：禽呼肠孤病毒(ARV)主要感染鸡和火鸡,在鸡群中普遍存在,常与其他疾病混合感染,临床上表现多种病症,导致鸡的生长能力下降及死亡率升高。为了更有效的预防和控制ARV,降低ARV对养禽业的危害,本课题开展了ARVM1、M2基因的克隆与序列分析及病毒受体的初步研究,并应用SYBRGreenⅠ染料建立了ARV的荧光定量RT-PCR检测方法。根据GenBankARVM1、M2基因序列,设计两对引物,分别对9株ARV的M1、M2基因进行了RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示,所构建的克隆质粒中含相应的M1、M2蛋白基因完整ORF,大小分别为2199bp和2031bp,分别编码732和676个氨基酸的μA和μB蛋（此处忽略..）白;经分析,测序的9株ARVM1、M2基因核苷酸及其推导的氨基酸序列具有高度的同源性,M1基因在99.3%～99.7%和99.3%～99.7%之间,M2基因在98.7%～99.9%和97.8%～99.9%之间。与GenBank上其他呼肠孤病毒株包括美国分离株(2408)、日本分离株(OS161)和4株台湾分离株(1017-1、601G、750505、916SI)进行比较,结果表明所有毒株M1基因的核苷酸和氨基酸同源性都较高,分别在88.3%～100%和97.0%～100%之间;M2基因与2408株和1017-1株的核苷酸和氨基酸同源性高,均在98%以上,而与其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性较低,仅在69.5%～72.0%之间和85.5%～89.5%之间;遗传进化树分析表明M2基因中多数台湾株和日本株变异大。将培养的鸡胚成纤维细胞接种ARVS1133病毒株以增殖病毒,待细胞病变达60%-80%时收毒,冻（本文此处忽略..）融三次后通过差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化病毒,经紫外分光法测病毒蛋白浓度为6.25mg/mL。提纯鸡胚原代肝细胞膜蛋白测浓度为16mg/mL。取24uL浓度为16ug/uL的膜蛋白经SDS-PAGE电泳后,采用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)即膜蛋白电泳后转移到硝酸纤维素膜上依次与病毒、抗血清和酶标二抗作用显出病毒受体结合带的方法结合Bandscan分析病毒受体分子量为68.6kDa。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域设计一对扩增片断为147bp的特异性引物,将PCR扩增的σC基因片段,连接pGM-T载体,重组质粒经筛选、PCR鉴定及测序进一步证实,表明σC片段正确克隆入pGM-T载体（略..）中,命名为pGM-T-σC。提取质粒用SalⅠ单酶切得到线性化转录模板DNA,体外转录出RNA,以体外转录的RNA为标准品制定标准曲线,应用SYBRGreenⅠ染料建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法荧光定量RT-PCR方法。结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,在5.2×10~2-5.2×10~9拷贝/uL之间呈良好的线性关系,可检测到每个反应相当于5.2×10~2个拷贝的标准品RNA;该方法特异性好,与NDV、IBDV、MG都不反应。本课题开展了ARVM1、M2基因的克隆与序列分析及用VOPBA鉴定了ARV受体的分子量,为进一步研究病毒各蛋白间的相互作用、病毒与宿主的相互关系及基因组与致病（文章此处忽略..）性的关系提供重要参考。应用SYBRGreenⅠ染料成功建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法,为ARV的流行病学、致病机理研究及快速诊断与防治等方面提供了重要的技术支撑。

以上为本篇毕业论文范文禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立的介绍部分。

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