GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭跟增殖才能的影响

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GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭跟增殖才能的影响

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毕业论文范文题目：GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭跟增殖才能的影响，论文范文关键词：GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭跟增殖才能的影响
GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭跟增殖才能的影响毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：[课题背景]前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是男性生殖体系最为常见的恶性肿瘤,其发病率为欧美国度男性恶性肿瘤的第1位跟逝世亡率第2位。我国PCa的发病率虽低于欧美国度,但跟着生活方法改变、人口老龄化及前列腺特异性抗原(PSA)广泛利用于筛查,近年来,PCa的发病率呈明显回升趋势。国内一项PSA筛查研究发明,50岁以上男性的前列腺癌发病率为0.78%,提示中国的前列腺癌实际发病率并不低。因此,寻找前列腺癌有效医治方法已成为一个急待解决的世界性公共卫生问题。生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的情势存在,糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。N-糖链的构造改变是细胞恶性转化的关键步骤,在肿瘤细胞中,复杂糖链的构造产生异样改变,且这种变更与肿瘤侵袭转移密切相干。N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(N-acetylglucosaminyltransferaseV,GnT-V)是一个与肿瘤及肿瘤转移相干的酶,研究表明GnT-V在很多恶性肿瘤中增多,其产物GIcNAcβ1,6Manαl,6构造有利于外链的延长,已发明该构造与细胞的恶性转化跟肿瘤的转移有密切关联。基因医治是一种有前景的肿瘤医治手段,RNA烦扰(RNAinterference,RNAi)技巧是近年来敏捷发展起来的一项新的基因功能研究手段,它是利用与靶基因同源的小片段双链RNA(dsRNA),即：siRNA,转染靶细胞,促进靶基因mRNA降解,从而特异性引诱转录后基因沉默。将siRNA所对应的模板DNA双链序列克隆入质粒转染细胞,DNA模板在细胞内转录成小片段发夹状]RNA(shRNA),与化学合成的小烦扰RNA(siRNA)存在雷同的基因封闭作用,但作用时光可长达2个月,因其特异性跟高效性成为当前肿瘤基因医治的热点。本实验利用RNAi原理跟技巧,针对前列腺癌中高表白基因GnT-V的shRNA表白质粒,将其转染高转移潜能的人前列腺癌PC-3细胞,察看RNAi对GnT-V基因表白的克制效应,寻找克制效力较高的RNAi片段,为寻找有效医治前列腺癌分子靶向研究中新靶点提供实验根据。[实验方法]1、pGPU6/GFP/NeoG（略..）nT-VshRNA质粒的构建及鉴定(1)GnT-VsiRNA序列的设计：根据NCBI数据库中GnT-V基因已知序列(NM_002410.3)跟siRNA设计准则,设计针对GnT-VcDNA的RNA片段,其序列为：GnT-V/1079sense'GGAAGTGCATGCAACTGTTTA3';经Blast检索确认与GnT-V以外的人类已知基因序列无同源性。将其中一对的序列打乱排列,通过Blast分析无同源性超过70%的序列,作为阴性对比烦扰序列,序列为：GnT-V/NCsense5'GTTCTCCGAACGTGTCACGT3'。由上海吉玛公司采取化学合成方法合成上述siRNA。(2)shRNA转录模板DNA的设计：根据前面设计的siRNA序列,设计模板DNA链,其次序分辨为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9ntloop连接序列、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、BamHⅠ酶切位点。(3)质粒pGPU6/GFP/NeoGnT-V的构建及鉴定：先将各组2条模板单链退火处理,再与双酶切后的pGPU6/GFP/Neo质粒连接,构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,利用限度性内切酶BbsⅠ跟BamHⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后,抽提质粒纯化。2、细胞培养与转染人前列腺癌细胞株PC-3在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,37℃、5%CO2湿度下培养,每周传代2～3次。PC-3细胞培养至对数成长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品阐明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入PC-3细胞。3、烦扰后果检测(1)半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GnT-VmRNA表白转染成功后,持续培养PC-3细胞48h后,收集细胞,经Trizo1一步法提取总RNA,采取AMV逆转录合成cDNA,进行PCR反应。GnT-V上游引物为5’AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC3',下游引物为5’TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT3',产物长度为555bp。PCR反应前提：94℃预变性5min,94℃变性30s,40℃退火30s,72℃延长30s,共30个轮回；最后72℃再延长10min.以β-actin为内参,上游引物（此处忽略..）为5'GAMCTACCTTCAACTCCATC3'下游引物为5’CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC3',产物长度为219bp。以扩增产物3μl在2%琼脂糖凝胶中电泳,摄像后利用Image.ProPlus6.0软件进行光密度分析,用GnT-V/β-actin灰度比值作为GnT-V的绝对表白程度。(2)蛋白质印迹(Westernblot)检测GnT-V蛋白表白转染成功后,持续培养PC-3细胞72h后,每组收集1×107个细胞,经细胞裂解液提取总蛋白并进行定量。取50μg总蛋白进行SDS—PAGE电泳实现后,电转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉的PBST缓冲液封闭PVDF膜。而后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗体(1：200)、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体(1：1000)4℃孵育过夜,洗膜后分辨参加HRP标记的兔抗羊IgG(1:400)、HRP标记的羊抗鼠IgG(1：9000),室温下动摇1h,按阐明书利用化学发光底物进行显色,成像,底片扫描后利用Image.ProPlus6.0软件进行光密度分析,用GnT-V/GAPDH代表GnT-V的绝对表白程度。4、GnT-VshRNA对PC-3细胞增殖、粘附及侵袭的影响(1)CCK-8法检测细胞增殖性取各组对数成长期的待测细胞,CCK-8法分析不同时光点(0h、24h、48h、72h、96h)的细胞活力,每个时光点分辨检测8个复孔。测量两组的OD450nm值,绘制成长曲线,并打算烦扰组的成长克制率。细胞成长克制率(IR)=(对比组OD450值—烦扰组OD450值)／对比组OD450值×100%.(2)异质粘附实验取各组对数成长期的待测细胞,每组设24个孔。细胞用无血清RPMI1640培养过夜。Matrigel胶50μL／孔铺96孔板,10g/LBSA煮沸13min变性后封闭,按5×103／孔参加细胞悬液,37℃孵育1h。1×PBS冲刷3次,CCK-8法测量各组OD450nm值。(3)趋化活动实验取对数成长期的细胞,用无血清RPMI1640培养过夜。通过24孔趋化小室检测细胞迁徙性,趋化因子为10%新生牛血清。成果表示为穿过聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔随机取5个高倍镜视线计数(400×)。(4)划痕愈合实验取对数成长期的待测细胞,细胞接种于包被CollagenⅣ的6孔板,培养至细胞浮现出单层贴壁成长状况。分辨在各组单细胞层上划痕,用含10%FBS的培养基持续培养以使划痕愈合。分（略..）辨于划痕后0h、12h、24h、36h每个孔取4个视线拍照,察看划痕愈合才能,用愈合率代表愈合才能。愈合率=[(愈合前两侧细胞层间隔-愈合后两侧细胞层间隔)／愈合前两侧细胞层间隔]×100%.(5)细胞侵袭实验取对数成长期的细胞,用无血清RPMI1640培养过夜。通过24孔趋化小室跟matrigel胶检测细胞侵袭性.成果表示为穿过matrigel胶跟聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔随机取5个高倍镜视线计数(400×)。[统计学方法]实验数据以x±s表示,采取SPSS13.0软件进行数据统计分析,两组比较采取t测验,多组比较采取方差分析,P0.05表示差别有统计学意思。[成果]1、重组体的双酶切及测序鉴定将重组质粒pGPU6/GFP/NeoGnT-V/1079、pGPU6/GFP/NeoGnT-V/NC用BbsⅠ跟BamHⅠ双酶切,酶切产物进行电泳检测,发明重组体中已成功插入目标片段。测序鉴定成果与设计序列完全相符,所含目标基因序列正确无误。成果表明GnT-VshRNA及阴性对比shRNA成功构建于pGPU6/GFP/Neo载体上,重组质粒构建成功。2、siRNA的牢固转染质粒pGPU6/GFP/Neo中含有编码GFP的基因,故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。在荧光显微镜下察看,所有转染细胞均发荧光,阐明牢固转染成功。3、GnT-VsiRNA对PC-3细胞GnT-V在mRNA及蛋白方面表白的影响PC-3GnT-V/1079组细胞GnT-V基因的表白较PC-3GnT-V/NC组明显降落,表明转染GnT-VshRNA载体能克制目标基因mRNA表白。Westernblot成果也显示转染GnT-VshRNA载体能克制GnT-V蛋白表白。Image-ProPlus6.0软件分析GnT-V基因mRNA及蛋白的表白程度,按照公式进行打算后显示PC-3GnT-V/1079组mRNA程度的克制率为76.5%,蛋白程度的克制率为67%,与PC-3GnT-V/NC组比拟均有统计学意思(P0.001)。4、GnT-VshRNA对细胞增殖的影响以细胞在不同时光点(0h、24h、48h、72h、96h)的OD450nm值绘制细胞成长曲线,并打算出PC-3GnT-V/1079的成长克制率,可见GnT-VshRNA对PC-3细胞增殖（略..）呈明显克制造用,尤以48h为著,与对比组比拟均有统计学意思(P0.001)。5、GnT-VshRNA对细胞粘附性、活动性跟侵袭性的影响以Matrigel胶模仿基底膜进行粘附实验,成果显示下调GnT-V表白可加强PC-3细胞的粘附才能(t=—2.361,P0.05),而明显克制PC-3细胞的趋化活动性(t=15.057,P0.001)。划痕实验也显示克制GnT-V表白明显延长PC-3细胞的愈合时光。用Matrigel胶介导的细胞侵袭实验成果显示,PC-3GnT-V/1079、PC-3GnT-V/NC的穿膜细胞数分辨为(6.20±1.70)个跟(37.90±3.46)个,PC-3GnT-V/1079组的穿膜细胞数较阴性对比组明显减少(t=36.733,P0.001),表明下调GnT-V表白可明显克制PC-3细胞的侵袭才能。[论断]1、靶向GnT-V的shRNA表白质粒可能明显下调人前列腺癌PC-3细胞GnT-V的mRNA跟蛋白表白。2、下调GnT-V的表白后,PC-3细胞的体外增殖、迁徙跟侵袭才能受到克制。3、存在较高克制效力的GnT-VsiRNA序列可能成为医治前列腺癌的有效靶点。

以上为本篇毕业论文范文GnT-V RNAi对人前列腺癌PC-3细胞侵袭跟增殖才能的影响的介绍部分。

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