cagA转基因小鼠模型的建立及致病机制的初步研究

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cagA转基因小鼠模型的建立及致病机制的初步研究

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毕业论文范文题目：cagA转基因小鼠模型的建立及致病机制的初步研究，论文范文关键词：cagA转基因小鼠模型的建立及致病机制的初步研究
cagA转基因小鼠模型的建立及致病机制的初步研究毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一种螺旋形、微需氧、具有端生鞭毛的革兰氏阴性杆菌。全球超过50%的人感染该菌,如不接受治疗则终生持续感染。接近30年的研究显示,H.pylori感染与胃肠道疾病的发生密切相关。在1994年,该菌被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌因子。H.pylori感染引发的胃肠道疾病包括慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤(MALT)及胃腺癌。CagA蛋白是H.pylori致病的重要毒力因子之一,被列为至今首个来自细菌的癌蛋白。H.pylori利用IV分泌系统(TypeIVsecretionsystem,TFSS)将CagA蛋白注入到宿主胃上皮细胞中。进入细胞的CagA蛋白定位在质膜表面,并被细胞内酪氨酸激酶磷酸化。通过依赖和非依赖酪氨酸磷酸化的方式,CagA蛋白可以与宿主胞内多达20种蛋白发生直接相互作用、破坏多种信号通路,从而促进胃上皮细胞的恶性转化。CagA蛋白的羧基端具有显著的多态性。根据羧基端含有EPIYA片段的种类和数量,可以将CagA蛋白分为两种主要亚型:东亚型(EastAsian)和西方型(Western)CagA蛋白。值得注意的是,在胃癌高发国家,如日本、朝鲜和中国,流行的H.pylori都具有东亚型CagA蛋白;在胃癌低发国家或地区,如欧洲、北美和澳大利亚,流行的H.pylori则具有西方型CagA蛋白。对不同亚型CagA蛋白的研究,或可为解释世界各地胃癌发病率和死亡率的差异提供线索。本课题构建了两种不同亚型CagA真核表达载体,将其分别转染胃上皮细胞AGS（文章此处忽略..）后,筛选得到了稳定转染细胞株;利用全基因表达芯片检测了不同亚型CagA蛋白对胃上皮细胞基因表达谱和功能的影响,并进行了部分实验验证。与此同时,构建了两种亚型cagA转基因小鼠,阳性鼠获得了明显的病理表型变化。本研究共分为以下三部分:1.cagA基因的优化、人工合成及分析我们选择两个H.pylori菌株:H.pylori98-10和H.pyloriCa52,它们分别含有东亚型(ABDCagA)和西方型(ABCCagA)CagA蛋白。对它们的cagA基因序列进行分析,发现它们富含AT、剪切位点及ATTTAmotif。在真核细胞中,过高的AT含量可能导致基因沉默,而且ATTTAmotif是mRNA的降解基序。为了避免这些因素对cagA基因表达的影响,本实验根据(http://www.kazusa.org.jp/codon)提供的人密码子使用频率表,以人偏爱密码子替换H.pyloricagA基因的密码子,并调整AT含量、去除ATTTAmotif和隐蔽的剪接位点。利用重叠PCR,人工全合成了优化的cagA基因(cagA~(HS)),并在cagA~(HS)基因3′端连接了一个HA标签,获得了cagA9810~(HS)–HA基因和cagACa52~(HS)–HA基因。将cagA~(HS)-HA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组表达载体。将重组质粒瞬时转染胃上皮细胞AGS,应用RT-PCR和WesternBlottling分别检测cagA~(HS)-HA基因的转录和蛋白表达。结果表明,优化的cagA~(HS)-HA基因能够有效、完整地表达CagA蛋白。2.不同亚型CagA蛋白对胃（本文此处忽略..）上皮细胞AGS功能的影响利用cagA9810~(HS)–HA基因和cagACa52~(HS)–HA基因的重组表达载体转染AGS细胞,筛选耐G418的细胞克隆。通过PCR、RT-PCR及WesternBlotting筛选鉴定cagA9810~(HS)–HA基因和cagACa52~(HS)–HA基因稳定表达的AGS细胞系。从稳定表达cagA9810~(HS)–HA基因和cagACa52~(HS)–HA基因的AGS细胞系培养物中提取总RNA,利用华联的HOA5.1基因表达芯片分别检测CagA98-10蛋白和CagACa52蛋白对AGS细胞转录谱的影响。对差异表达基因进行分析,结果表明CagA98-10蛋白和CagACa52蛋白显著影响多种细胞功能,而且这两种亚型CagA蛋白对细胞的影响和强度并不相同。芯片结果显示:(1)CagA9810蛋白引起121个基因的转录显著变化(p≤0.01,FC≥2);其中转录上调的基因有61个,转录下调的基因有60个。上调最大的10个基因是LOC100287188、FPR3、PPT2、XIST、SERPINB2、FSCN1、C6orf222、FAM109B、ITGA2和HOXB7,变化范围在3.3至36.7倍;下调最大的10个基因是NOTCH3、PLP1、H19、LY6D、TCF4、AMOT、CERK、SOHLH2、MAGED1和FBXO2,变化范围在-4.8至-9.3倍。(2)被CagACa52蛋白显著影响的基因有388个(p≤0.01,FC≥2);其中有148个基因的转录上调,有240个基因的转录下调。上调最大的10个基因是SEMA5A、OLR1、TPPP、AKR1C3、C12orf59、PRSS35、ANXA1、SLC40A1、DKK1和HPGD,变化范围在3.8至9.6倍;下调最大的10个基因是DHRS2、UGT1A10、FPR3、TUBA1A、SYNPO、RSAD2、WNT6、FBXO2、（本文此处忽略..）CD40和MAP1B,变化范围在-10.5至-98.8倍。(3)被CagA9810蛋白和CagACa52蛋白同时影响的基因有44个(p≤0.01,FC≥2);同时上调的基因有ACTG2、CCDC80、GNE、GPR126和SARM1;同时下调的基因有AMOT、ANK1、C5orf13、C9orf169、FBXO2、GPRC5D、H19、IGFBP2、KCNN4、KLK6、LGALS3BP、LY6D、MAP1B、NCAM1、NOTCH3、PLA2G2A、PLP1、PSG1、RENBP、SULT2B1、TCF4、TMEM187、TRIB3、TUBA1A、UGT1A10和WNT6;调节相反的基因有F5、NKAIN4、CA2、BIRC7、FPR3、DMBT1、FPR3、CA2、CREB3L3、DKK1、SEMA3C、CFTR和SEMA5A。CagA9810蛋白显著影响的细胞功能包括:对刺激的应激反应功能、营养功能、免疫防御功能和微管形成功能。CagACa52蛋白显著影响的细胞功能包括:甾类激素刺激的应激反应功能、炎性反应的调控功能、外部刺激反应的调控功能、循环系统功能。CagA9810蛋白和CagACa52蛋白同时影响的细胞功能有包括:细胞黏附功能、细胞运动功能、细胞分化的正调控功能、微管的形成功能、外部刺激的应激反应功能、激素刺激的应激反应功能、机械刺激和损伤修复的应答功能。本研究不仅首次系统地揭示了CagA蛋白对AGS细胞表达谱的影响,并比较了不同亚型CagA蛋白对细胞功能的影响。3.cagA转基因小鼠的构建与病理变化为实现CagA在胃组织特异性表达,在cagA9810~(HS)基因和cagACa52~(HS)基因的5′端分别连接小鼠H+/K+-ATPase4β亚基的启动子。经显微注射,把转基因片段注射到小鼠的受精卵（文章此处忽略..）雄原核中。经PCR和RT-PCR鉴定,获得两个cagACa52~(HS)转基因小鼠品系;六个cagA9810~(HS)转基因小鼠品系。cagA转基因小鼠的体重和行为并无明显异常。在cagACa52~(HS)转基因小鼠的肝、脾、肺、肾、胃和肠中均检测到转录,说明H+/K+-ATPase4β亚基的启动子并非具有严格的组织特异表达特性,存在渗漏表达现象。CagA9810转基因小鼠的鼠龄还小,暂时未观察到明显病变。然而,9月龄的CagACa52转基因小鼠,胃黏膜层出现炎症反应和异常增生。14月龄的CagACa52转基因小鼠,出现严重的炎症反应、异常增生、类肠上皮化生以及异型核等癌前病变。这些结果证明CagA是重要的癌蛋白,单独CagA足以诱导肿瘤发生。

以上为本篇毕业论文范文cagA转基因小鼠模型的建立及致病机制的初步研究的介绍部分。

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