大鼠背根神经节膜联蛋白A2跟β5微管蛋白真核表白载体的构建及表

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大鼠背根神经节膜联蛋白A2跟β5微管蛋白真核表白载体的构建及表

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毕业论文范文题目：大鼠背根神经节膜联蛋白A2跟β5微管蛋白真核表白载体的构建及表，论文范文关键词：大鼠背根神经节膜联蛋白A2跟β5微管蛋白真核表白载体的构建及表
大鼠背根神经节膜联蛋白A2跟β5微管蛋白真核表白载体的构建及表毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：[研究背景]神经病感性苦楚悲伤是神经体系伤害引起的一种慢性状况,重大困扰人类的健康。背根神经节(dorsalrootganglia,DRG)作为痛觉传入的第一级神经元,在神经病感性苦楚悲伤的外周机制中起侧重要作用。目前有研究表明细胞骨架及其相干蛋白如膜联蛋白A2(annexinⅡ,annexinA2)跟β5微管蛋白(tubulinbeta-5/beta5-tubulin)与DRG侵害性感触传导过程关联密切,但分子机制尚不明白。本实验利用基因工程的技巧,提取大鼠DRG中annexinⅡ的基因Anxa2跟tubulinbeta-5的基因Tubb5,构建其真核表白载体,并对其在哺乳动物细胞中的表白作初步鉴定,以期为深刻研究annexinⅡ跟(?)tubulinbeta-5在调控DRG侵害性感触传导过程中的分子机制及明白与其彼此作用的蛋白奠定基本。[研究目标]克隆大鼠背根神经节annexinⅡ跟tubulinbeta-5的基因,构建真核表白载体并检测其表白。[研究方法]提取大鼠腰部背根神经节组织总RNA,RT-PCR法扩增大鼠DRG细胞中ann（本文此处忽略..）exinⅡ的基因Anxa2跟tubulinbeta-5的基因Tubb5,分辨构建pGMT-Anxa2跟pGMT-Tubb5克隆载体。以此为模板,设计含有flag标签序列的引物序列,高低游分辨插入HindⅢ、NotⅠ酶切位点,PCR扩增Anxa2-flag跟Tubb5-flag序列,并与pcDNA3.1(+)空载体行连接转化Top10感触态细胞,在Amp琼脂平板上筛选克隆。抽提质粒后行PCR及酶切鉴定,鉴定为阳性克隆者用T7、BGH引物对其进行全序列测定分析。从而获得表白载体pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag跟pcDNA3.1(+)-Tubb5-flago采取Lipo2000脂质体法将表白载体转染到六孔板培养的HEK293细胞中,设表白载体组、pcDNA3.1(+)空载体对比组跟空转HEK293细胞的阴性对比组。细胞免疫荧光检测需当时制成细胞爬片,转染48小时后分辨以小鼠源性anti-flag抗体(1:200).FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1：200)孵育,DAPI染核、封片后于倒置荧光显微镜下察看成果并照相。FITC激发后可产生绿色荧光,唆使目标蛋白annexinⅡ或tubulinbeta（略..）-5的分布；DAPI激发后可产生蓝色荧光,唆使细胞核的分布。六孔板(未置爬片)细胞转染48-72小时后,收集细胞提取蛋白。以小鼠源性anti-flag抗体为一抗(1：500)、辣根过氧化物标记的IgG-HRP为二抗(1：5000)行Westernblot法检测。[成果]1.PCR扩增Anxa2/Tubb5的mRNA编码序列：Anxa2跟Tubb5大小分辨为1020bp跟1335bp。行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,成果可见Anxa2样品条带约为1000bp左右,Tubb5样品条带约为1300bp左右,与预期成果雷同,PCR扩增成功。2.pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5克隆载体鉴定：pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5质粒样操行1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观看均有亮带,示有质粒提出；选取最亮条带的质粒样操行序列测定,成果示克隆载体pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5构建正确。3.PCR扩增出Anxa2-flag跟Tubb5-flag片段：Anxa2-flag跟Tubb5-flag的大小分辨为1044bp跟1359bp。行1%琼脂糖凝胶电泳,可见Anxa2-flag条带在1000-1100bp之间,Tubb5-flag条带在1300-1400bp之间,与预期成（本文此处忽略..）果雷同,PCR扩增成功。4.重组质粒的鉴定：以重组质粒pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag跟pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag为模板行PCR,产生约为1044bp跟1359bp的条带；质粒经HindⅢ跟NotI双酶切鉴定,可分辨切开约为1044bp跟1359bp的小片段；酶切鉴定正确者行序列测定,成果示重组质粒pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag跟pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag构建成功。5.细胞免疫荧光检测目标蛋白及细胞内定位：pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag组FITC激发后产生绿色荧光,唆使目标蛋白annexinⅡ有牢固表白,并且广泛均匀分布于胞质跟胞膜；pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag组,FITC激发后亦有绿色荧光,广泛分布于胞质跟胞膜,唆使目标蛋白tubulinbeta-5表白。两组实验中转染pcDNA3.1(+)空载体组跟阴性对比组的HEK293细胞内均未检测到标记目标蛋白荧光信号。6.Westernblot法检测annexinⅡ蛋白跟tubulinbeta-5蛋白的表白：pCDNA3.1(+)-Anxa2-flag跟pCDNA3.1(+)-Tubb5-flag表（略..）白载体组分辨在绝对分子品质约为36KD、50KD处呈现单一蛋白条带,pcDNA3.1(+)空载体对比组跟阴性对比组无特异条带呈现,且内参β-actin表白较均一。[论断]成功构建pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag跟pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag真核表白载体,并在体外牢固表白蛋白,为研究annexinⅡ跟tubulinbeta-5调控DRG侵害性感触传导的分子机制奠定基本,为进一步探讨神经病感性苦楚悲伤的防备跟医治方法提供新的思路。

以上为本篇毕业论文范文大鼠背根神经节膜联蛋白A2跟β5微管蛋白真核表白载体的构建及表的介绍部分。

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