人神经营养素-3成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性检测

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人神经营养素-3成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性检测

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毕业论文范文题目：人神经营养素-3成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性检测，论文范文关键词：人神经营养素-3成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性检测
人神经营养素-3成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性检测毕业论文范文介绍开始：
【论文摘要】：神经营养因子(neurotrophicfactors，NTFs)作为促进神经细胞存活、生长、分化的一类分泌型蛋白，一直被人们所关注，主要包括神经营养素家族、胶质细胞源性神经营养因子家族等几大类三十余种蛋白质。神经营养因子通过与其受体结合，激活细胞内信号转导途径，它们具有多种生物学活性，对中枢神经系统中的海马胆碱能神经元、黑质多巴胺能神经元、蓝斑去甲肾上腺能神经元、纹状体GABA能神经元以及外周神经系统中的运动神经元、感觉神经元、交感神经元等多种神经元均有作用，对非神经系统也有一定影响。研究表明，神经营养因子不仅可以减少神经变性，阻止疾病进程，而且还具有刺激轴突（略..）生长、促进其再生的功能，极有可能成为未来治疗阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓损伤和外周神经病变等神经系统疾病的重要手段。神经营养素-3(neurotrophin-3)是神经营养素家族(neurotrophinfamily，NTs)成员之一，其mRNA在中枢和外周神经系统中广泛表达，两种受体分别为低亲和力受体p75~(NTR)和高亲和力受体TrkB，促进神经元生长、发育、分化和存活，对损伤神经元的修复与再生也有作用。本实验以人胎脑RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增了人神经营养素-3cDNA，并将其插入的质粒pGEM-T中，构建了克隆载体pGEM-T-hNT-3。（文章此处忽略..）应用酶切和PCR方法对阳性重组子进行了鉴定，并测定了阳性重组子的序列。结果表明，所克隆的入神经营养素-3cDNA核苷酸序列为35bp，与已发表序列(GenBankMW002527)同源性为99.7％，其编码119个氨基酸。利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，从克隆载体pGEM-T-hNT-3中得到人神经营养素-3cDNA，并将其与线性质粒pGEX-6p-1相连接，构建了人神经营养素-3原核表达载体pGEX-6p-1-hNT-3。将经酶切和PCR鉴定的阳性重组子转化到宿主菌BL21(DE_3)PlysS中，用IPTG作为诱导剂，以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察重组人神经营养素-3融合蛋白在阳性菌的表达情况，并摸索其最佳诱（文章此处忽略..）导条件。实验发现，重组人神经营养素-3融合蛋白在37℃和28℃诱导培养时均主要以包涵体形式表达，且在IPTG浓度为1.0mmol／L的条件下，37℃诱导4hr时，重组人神经营养素-3融合蛋白表达量最大；阳性菌诱导表达的融合蛋白分子量分别约为39.6kD，其中谷胱甘肽S-转移酶标签蛋白分子量约为26kD，人神经营养素-3分子量约为13.6kD。实验过程中对表达的重组人神经营养素-3融合蛋白包涵体进行了裂解，并采用谷胱甘肽氧化还原系统复性了溶解后的重组人神经营养素-3融合蛋白。用GS4B树脂纯化了重组人神经营养素-3，并对纯化蛋白进行了浓缩。为了检测所获得的重组人神经营养素-3的生物学活性，进行了体外培养神经（此处忽略..）元的实验。实验选用了新生24小时内小鼠脑组织，用无血清培养基Neurobasal联合B27添加剂纯化培养神经元。结果表明重组人神经营养素-3具有促进体外培养的神经元突触生长，促进神经元的存活的作用。本实验在原核表达系统BL21(DE_3)PlysS成功表达了人神经营养素-3，并对重组人神经营养素-3融合蛋白进行了功能分析，为进一步研究它的生物学功能提供了良好的条件，并为研究其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了基础。

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